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邓云老师

报告主题：A telomere-to-telomere gap-free reference genome of watermelon and its mutation library provide important resources for gene discovery and breeding

Q:老师您好，刚刚看到G42基因组的LAI并不算高，请问这是什么原因呢？

A: LAI指数就是完整LTR反转座子序列占总LTR序列长度的比值。这个计算公式决定了这个值受到鉴定完整LTR的数目的影响，目前LTR主要靠预测软件注释，可能因为注释不全造成本身LTR预测不完整影响LAI值。

Q:老师您好，请问在HiFi+HiC组装完后，有多少gap以及gap位置是怎么检测的呢？

A:可以通过统计序列中N的位置确定GAP的位置。

Q:邓老师 您好，我想问一下，西瓜T2T基因组构建使用的材料是什么？单倍体吗？还是普通的二倍体？

A:普通二倍体。

Q:老师我想请问一下，T2T基因组通过HIFIasm初步组装的contigs数有多少？

A:909个

Q:请问老师 如何评价t2t组装基因组的质量？

A:这篇文章主要用QV值和PCR以及多个测序数据交叉验证。

Q:邓老师您好，在着丝粒和端粒的gap有哪些好的方法进行补gap？

A:目前主要根据序列特异性还是手动填补。

Q:突变体库的突变位点密度在全基因组分布不均匀，怎么解释这种现象呢？

A:EMS诱变本身具有一定特异性，因作物不同而存在差异。着丝粒区域染色质结构紧密不易突变。另外突变致死位点的存在也是导致检测到的突变位点在全基因组分布不均匀的一个原因。

Q:想请教下邓老师：两个二倍体近源种植物杂交产生的F1代，对其进行组装，我们现在没有确切的父本、母本的个体的信息，而只是父本和母本的物种的二代数据信息，是不是也可以用Hifiasm的Trio模式进行组装呢？

A:可以。

Q:邓老师好，我看您后面针对端粒是用PCR扩增验证的，这个和CHIP验证有什么区别？

A: 在基因组组装中验证着丝粒序列主要用CHIP验证，比如水稻gap-free的组装，因为具有良好的研究基础，通过构建特异抗体，通过CHIP验证着丝粒序列，而本文中只预测了着丝粒的区间。对端粒仅仅部分进行了PCR验证。

Q:老师您好，请问西瓜T2T基因组注释文件可以拿到吗？

A:可以，西瓜基因组和突变体数据库网站上可以下载（Watermelon Database (watermelondb.cn)）。

Q:老师能讲下着丝粒的注释方法吗？

A: 着丝粒注释这篇文章中主要基于着丝粒本身的序列特征100-200bp的简单重复序列，通过全基因组扫描这种序列结合HIC数据鉴定。

Q:用Hifiasm的Trio模式组装异源二倍体植物的两套基因组，来自两个亲本的两套染色体之间可能会发生的结构变异是不是就检测不到了，组装出来的这两套单倍型是不是就是完全独立的来自两个亲本的两套染色体，直接排除了来自亲本的两套染色体之间可能发生的重组的情况？

A: 异源二倍体？不知道能否检测得到，也不知道会不会重组，感觉这是个生物学问题而不是组装问题。

Q:智能温室里面西瓜一年可以长几代？

A:目前我们的条件下可以种植3-4代。

Q:Pcr的方法是依据测序结果的两端设计引物吗？

A:是的。

张宜林老师

报告主题：The telomere-to-telomere gap-free genome of four rice parents reveals SV and PAV patterns in hybrid rice breeding

Q:张博士好，想请问下从最初的EVM结果到最后的基因集，是采用什么样的方法过滤基因的？

A:根据基因与TE位置的重叠不能超过20%，以及基因长度两方面进行过滤，也就是说长度过短的基因会被直接过滤掉。

Q:请问老师，用ONT组装hifi补gap或者反过来操作哪种更好呢？

A: 基本都差不多，视情况而定。

Q:老师您好，请问一下怎么鉴定着丝粒位置呢？

A:文章方法里有详细描述。

Q:您好，还是想问一下初始染色体水平组装后，gap是怎么检测的呢？

A:初始染色体水平组装后由于是contig水平，所以是没有gap的，首先应该利用Hi-C或者参考基因组把contig连接成Scaffold后形成gap，之后相应软件会利用N将这部分连接起来，然后再去检测N的位置，就可以检测到gap。

Q:请问老师，用ONT组装hifi补gap或者反过来操作哪种更好呢？

A:对于这个问题，现阶段我认为是HIFI组装，然后用ONT去补gap更合理一些，因为HIFI组装的准确性更高一些，完整性也许也较高，而ONT得到的片段更长，所以对于HIFI没测到的区域可能刚好可以跨越过去；用ONT组装的话，也就是说如果长的reads都无法跨越某个区域的话，HIFI的reads可能难度就更难以实现。

Q:张博好，想请问一下，对于hifi的结果和ont的结果，怎么整合到一起呢？主要是通过人工吗？

A:目前我还没有看到过关于两个基因组完全组合的方法，我们现在基本上是使用reads或者组装好的基因组去motify另一个基因组；我认为不是完全整合，它是以一个基因组为骨架，另一些测序数据或者另一些组装结果去motify另一个基因组。

Q:谢谢张博士精彩的报告，测序深度那么高，数据量非常丰富。但考虑到成本，你觉得测序深度多少性价比最高？

A:首先，我觉得这个可能不是考虑到成本，而是应该考虑到目的，才决定了测序深度；此外，最低的测序深度我认为是25X，可能HIFI不能低于25X，至于具体测多深呢，我觉得应该综合经费和目的去选择，而且测序深度越高的话，计算量越大，也需要考虑到计算资源是否充足。

Q:张老师您好，我想问一下西瓜的ont数据具体是什么填补gap的，谢谢！

A:我们的策略是以HIFI为骨架，用ONT去补gap的，也就是说两种方法各自组装，然后最后相互补充和验证，另外，西瓜的ONT我们组装出来就是gapless的11条contig，是和染色体完全对应的。比如刚刚展示的一个图，也就是ONT帮助把HIFI连接不起来的部分连接起来，然后，对于这些gap的区域，我们可以用PCR去验证。当然，ONT数据也可以不去组装，直接用reads去补gap，我认为这两种方法得到的结果应该是一样的。

Q:不用hic，用ont和pacbio组装出来的contig，数量还是比染色体数量多一点，这怎么办呢？

A:如果有与目的材料非常类似的基因组的话，可以用已有的基因组去挂载，但是如果没有类似的基因组或者目的材料是个新物种的话，建议还是一定要把HI-C补上。

Q:各种方法补完还有个位数gap，有什么经验可以补上吗？

A:因为对你所说的使用过的方法不太明确，所以这里暂时提供不了什么经验。

Q:gap 您是通过单条reads 跨过还是 多条reads延伸呢？

A:多条。

Q:请问张老师，对于同源多倍体的组装，杂合率高，有什么更好的组装策略吗

A:目前没有。

Q:请问有用hifi对ONT的原始测序reads进行纠错的操作吗

A:有。

Q:谢谢张博士的精彩报告，因为我看目前T2T发表的相关文章都是一些已经有基因组发表的文章，请问对于没有基因组发表的物种来说，直接用T2T测基因组后期好分析吗？

A:后续比较基因组学或者群体遗传学的分析和之前有无基因组发表不搭嘎。结合自己的材料、生物学故事进行后期分析，没有好不好分析。

Q:张博，水稻和西瓜的组装草图(contig)的misassembly情况如何

A:没有misassembly的情况。

Q:张博好，仅有HiFi能实现gap free基因组吗？

A:这个难度应该比较大，需要看基因组的复杂程度如何，而且HIFI的话，我认为如果测到一定的深度之后再测的话它的效果提升也不大，就是说测50X和测150X可能区别不大，我感觉还是得通过多种策略去实现gap-free这个目标。总的来说，还是需要看基因组的复杂程度，也许可以。

Q:张博士好，请问西瓜基因组中gap是否集中在着丝粒区域，有没有重要gene落在gap里？gap-free的基因组对育种的价值更多体现在哪里

A: 这个问题可以详细参考西瓜基因组文章。

Q:二代测序的作用是什么？

A: 基因组Survey，回比基因组、基因组polish。

Q:相对于传统手段组装的基因组，T2T基因组会提高预测到的编码基因的数量吗？

A: 基因组完整性提高了，自然会提高基因的数量。