Poly(A) 尾是真核生物 mRNA的重要特征，在细胞质poly(A) 结合蛋白(PABPC)的作用下，在促进 mRNA的翻译和保护 mRNA的完整性方面起着至关重要的作用。Poly(A)尾的长度受Poly(A)聚合酶和去腺苷酶的动态调控，Poly(A)尾缩短到一定的阈值可以释放 PABPC，并引起 mRNA衰变。越来越多的证据表明，改变Poly(A)尾长度在调节基因表达中起着重要作用。因此，构建一个不同的物种，不同的组织类型的Poly(A)综合图谱，将极大地促进植物Poly(A)调控的研究。

该研究构建了不同物种，不同组织的Poly(A)综合图谱。在大多数组织中，Poly(A)尾在~20nt和~45 nt处出现峰值，而花粉中的Poly(A)尾则在~55nt和~80 nt处出现峰值。此外，Poly(A)尾长以基因特异性方式调节——半衰期短的mRNAs通常有较长的Poly(A)尾，而半衰期长的mRNAs具有相对较短的Poly(A)尾。在不同物种中，细胞核中的Poly(A)尾几乎是细胞质中的两倍长，表明在mRNA在细胞质中稳定之前，Poly(A)尾就发生了快速缩短过程。该研究将为探索Poly(A)长度的动态调控及其在植物基因表达调控中的作用提供一个重要的资源。

作者进一步优化了FLEP-seq 方法，并使用新发布的 Nanopore PCR-cDNA 测序试剂盒简化了文库构建，该试剂盒使用无连接酶快速连接测序接头，无ds-cDNA 修复、加A尾和接头连接步骤——将该方法命名为 FLEP-seq2。

提取了拟南芥的七种不同组织（幼苗、根、芽、叶、花序、种子、花粉）的总 RNA，以及三种重要作物的茎组织：玉米，水稻，大豆，每个样品两个生物学重复（图1d）。共构建了 20 个 FLEP-seq2 文库，每个文库都使用 MinION 芯片进行测序，

图1  FLEP-seq2 构建植物Poly(A)尾图谱

FLEP-seq2和 DRS 得到的总体Poly(A)长度分布高度相似。FLEP-seq2的两个生物学重复高度一致的，获得的全长信息可以同时获得每个转录本的剪接状态、Poly(A)位置和Poly(A)尾长(图1c)。表明，FLEP-seq2 是一种用于测量 Poly(A) 尾长的无偏、稳健且高通量的方法。

使用FLEP-seq2方法，共获得约 1.21 亿+  Poly(A)  reads（图 1d）。所有reads的 Poly(A)尾在~20 nt和~45 nt出现峰值（图1d，图1e）。在大豆和玉米等样品中也观察到~70 nt 处的峰值（图 1e）。这些峰通常间隔25 到 30 nt（图 1e），与PABPC 蛋白的足迹一致，表明植物中大部分 mRNA受到 PABPC 的保护。

为了研究不同基因Poly(A) 尾长的差异是否起源于新生 RNA，作者分析了拟南芥、水稻、大豆和玉米细胞核中新生 RNA的 Poly(A) 尾长。令人惊讶的是，核 RNA的Poly(A) 尾中值长度几乎是总 RNA的两倍（图2a）。总 RNA中含有内含子的转录本比完全剪接的转录本具有更长的 Poly(A) 尾（图 2b、2c），且含有内含子的转录本Poly(A)尾长度与核RNA的转录本Poly(A)尾长度相似（图2b，2d）。表明在剪接完成后，在细胞质中稳定之前，Poly(A)尾就会发生快速缩短过程。

图2 细胞核的Poly(A)尾比细胞质的长

此外，在4个物种中，约1/5的剪接异构体(不包括内含子保留)的Poly(A)尾长显著长于主要异构体 (图2e)。表明，新生 RNA具有长的Poly(A)尾，成熟mRNA的全局性去腺苷酸化发生在植物细胞的细胞质中。

利用已报道的 Arabidopsis mRNA半衰期的全基因组数据集，作者发现最不稳定转录本(即 mRNA半衰期最短的转录本)的 Poly(A)尾主要在70-150nt内富集。相反，稳定转录本的 Poly(A)尾显著短于核新生 RNA，通常在20-80nt 范围内富集(图2g，2h)。表明，稳定的 mRNAs 最初经历了去腺苷酸化，但随后被PABPs保护以防止进一步去腺苷酸化和衰变。

作者研究了Poly(A) 尾长是否存在组织特异性。虽然Poly(A)尾在大多数组织中的分布是相似的，但在花粉和种子中的分布模式不同(图1d，图3a)。其他组织的Poly(A)尾在20-30 nt 和40-60 nt 处富集，花粉的Poly(A)尾主要在40-60 nt 和70-90 nt 处富集(图1d，图3a)，说明花粉转录本可能受到更多聚合酶的结合和保护。与花粉类似，种子中的转录本也具有较长的Poly(A)尾(图1d，图1e，图3a)。表明，PABPs 对花粉和种子具有较强的保护作用，与前人的研究结果一致，即花粉和种子中的 mRNAs 通常是稳定的。

图3 植物Poly(A)尾的组织特异性和进化保守性

不同物种的Poly(A)长度分布非常相似，但也表现出一些差异(图1d，图3c)。与拟南芥相比，水稻茎有更多的带有极短Poly(A)尾的转录本(图1d) ，更多的基因的 Poly(A)长在10-20nt 处有一个峰值(图3c) ，因此中值 Poly(A)尾较短(图1d)。相比之下，玉米和大豆，特别是大豆，Poly(A)极短的转录本较少，但Poly(A)尾较长的转录本较多(图1d，图3c) ，且在60-80 nt 中表现出更高的峰值 (图1d，图1e) ，这可能是受PABPs 保护的转录本。尽管存在这些差异，同源基因的Poly(A)尾长在不同物种间显著相关 (图3d)，图3e展示了几种转录因子在不同物种中的Poly(A)尾长分布。表明，同源基因的Poly(A)尾长在不同物种中相对保守，可能进化选择的结果。

该研究构建了不同物种，不同组织的Poly(A)综合图谱。在大多数组织中，Poly(A)尾在~20nt和~45 nt处出现峰值，而花粉中的Poly(A)尾则在~55nt和~80 nt处出现峰值。此外，Poly(A)尾长以基因特异性方式调节——半衰期短的mRNAs通常有较长的Poly(A)尾，而半衰期长的mRNAs具有相对较短的Poly(A)尾。在不同物种中，细胞核中的Poly(A)尾几乎是细胞质中的两倍长，表明在mRNA在细胞质中稳定之前，Poly(A)尾就发生了快速缩短过程。该研究将为探索Poly(A)长度的动态调控及其在植物基因表达调控中的作用提供一个重要的资源。

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//www.biorxiv.org/content/10.1101/2022.01.21.477033v1.full