Direct RNA测序为Nanopore平台应用于转录组研究的顶尖测序技术。Direct RNA测序不经反转录、无需扩增，直接读取全长转录本，没有测序偏好性，能够准确检测RNA分子甲基化（m6A和m5C）等修饰位点，分析可变剪接、融合基因和鉴定新异构体；此外，还可对Poly（A）尾长度进行相对准确的估算，还原真实RNA特征，为疾病/肿瘤marker基因/转录本、动植物生长发育标志基因/转录本、胁迫响应基因/转录本的表达调控研究提供强有力的新策略。

假尿苷（Ψ）是尿苷的异构体，不影响Watson-Crick的碱基互补配对，由两种酶作用生成：H/ACA box snoRNAs和假尿苷生成酶（PUS）。Ψ是在细胞水平上由环境因素诱导形成的，被认为是RNA的一种不可逆修饰，其在mRNA的稳定，细胞内转录本的定位和翻译终止过程中起重要的作用。

假尿苷（Ψ）是哺乳动物转录组中丰富的mRNA修饰，但由于转录组范围内的定位困难，其功能一直难以确定。去年，美国芝加哥学者开发了一种NanoPsu方法，使用纳米孔直接RNA测序，对原始数据训练、机器学习建模和单个read连锁分析实现Ψ修饰的定量。

(来源：Huang，et al. Genome Biology)

AG代理基因模拟测通了NanoPsu算法，完美实现了Direct RNA测序分析中Ψ修饰位点鉴定、Ψ修饰isoform的功能富集等内容流程化，可以一键完成single-read分析，定位单个mRNA转录本中的多个Ψ位点。以下是Ψ修饰分析的内容展示：

1、Ψ位点鉴定及分布

利用NanoPsu算法鉴定转录本上单碱基水平的Ψ Position,计算覆盖到该甲基化位点的有效reads深度。并对所有基因的Ψ位点在结构（5‘UTR、CDS、3’UTR)上的分布情况进行统计。

表1 Ψ位点信息统计

图1 Ψ位点分布

2、Ψ motif 分析

在发生Ψ修饰的位点上下游分别扩展 2 个碱基，得到由 5 个碱基组成的 motif：

图2  样品Ψ motif

3、共有、特有Ψ位点鉴定

对各样本中得到的Ψ位点，进行样本之间共有和特有位点数量统计，绘制韦恩图。

图3 样品间Ψ位点的Venn图

4、组间特异Ψ位点转录本的功能富集分析

基于各样本中获得的共有和特有Ψ位点结果，得到组间特异Ψ位点，将含有特异Ψ位点的序列提取出来，进行表达定量与差异计算，得到组间特异Ψ位点转录本的功能富集结果。

图4 组间特异Ψ位点转录本的GO功能富集

图5 组间特异Ψ位点转录本的KEGG功能富集

至此，AG代理基因Direct RNA测序除能够准确检测RNA分子单个碱基位点的m6A和m5C修饰之外还能准确鉴定假尿苷修饰，为同时分析一条转录本上的多种甲基化修饰提供强有力的措施。

AG代理基因精研于direct RNA测序服务，处于行业领先地位。现已完成1000+样本的Direct RNA测序，覆盖动植物组织、动物细胞、真菌菌体等多样化样本。AG代理基因Direct RNA测序技术作为2019年10月份推出的新晋转录组研究技术，先后在iScience、Frontiers in Cell and Developmental Biology、mBio、Viruses等核心期刊发表项目文章，为RNA分子的表观遗传研究提供强有力的技术支撑。

参考文献

Huang et al. Interferon inducible pseudouridine modification in human mRNA by quantitative nanopore profiling.Genome Biology,2021