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项目文章|AG代理基因Nanopore全长转录组测序助力鸡卵泡选择的机制研究

 

近日,山东农业大学动物分子遗传与生物技术研究室姜运良教授团队以“Identification of genes involved in chicken follicle selection by ONT sequencing on granulosa cells”为题的研究论文在期刊“Frontiers in Genetics”上在线发表,该研究采用Nanopore测序技术解析了等级前卵泡(Pre-GCs)和分层卵泡(Post-GCs)中颗粒细胞的转录组图谱,鉴定出了鸡卵泡选择的候选基因,AG代理基因在该研究中承担了Nanopore全长转录组测序及分析工作。

 

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研究背景

 

性成熟的鸡卵巢中存在不同大小的卵泡,大致可分为Pre-GCs和Post-GCs。在产蛋期间,卵巢约每天一次从一群黄色小卵泡(SYF)中招募卵泡进入排卵前层级,这一过程被称为卵泡选择。卵泡的选择决定了卵泡的等级顺序,是影响蛋鸡产蛋性能的重要步骤。鸡中,卵泡选择前后颗粒细胞的形态和功能发生了显著变化:来自Pre-GCs的颗粒细胞是未分化的,并且仅能将少量胆固醇转化为孕酮;卵泡选择后,来自Post-GC的颗粒细胞对FSH产生应答并变成单层紧密间隔的立管(riser)以分泌大量孕酮。

 

本研究采用Nanopore测序技术对鸡Pre-GCs和Post-GCs颗粒细胞的差异表达基因和转录本进行鉴定,进一步分析了与卵泡选择相关的激素和细胞因子,深入揭示了鸡卵泡选择的分子机制。

 

材料方法

 

材料:35周龄海兰褐蛋鸡Pre-GCs和Post-GCs的颗粒细胞,每组3个重复。

测序平台:Nanopore  PromethION

 

研究结果

 

1、 测序质量和转录本结构分析

6个鸡样品的ONT转录组数据,分别鉴定到2,161,751 - 4,311,415个全长序列,共获得28,581个转录本。在7种选择性剪接(AS)类型中,A3占比最高,为25.28%,MX占比最低,为0.96%(图1A),它们也是显著AS中最多和最少的事件,比例分别为23.74%和1.12%(图1B)。此外,本研究鉴定了1,381个TF,其中大部分为zf-C2H2家族(图1C)。

 

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图1转录本的 AS、转录因子分析

 

2、 Pre-GCs和Post-GCs之间lncRNA的表达差异

通过Nanopore全长转录组测序,获得了7,243个lncRNA(图2D),其中459个(10.6%)为lincRNA,906个(21%)为反义lncRNA,2,288个(53%)为内含子lncRNA,664个(15.4%)为正义lncRNA(图2E)。和Pre-GCs相比,Post-GC中共鉴定出925个DE lncRNA(315个上调和610个下调),lncRNA表达变化倍数最大的是LOC107053110.t4(上调)和WSB1.t10(下调)。

 

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图2 转录本的lncRNA分析

 

3、 Pre-GCs和Post-GCs之间mRNA的表达差异

和Pre-GCs相比,Post-GCs中共鉴定了3,852个差异表达转录本(DETs)(1,755个上调和2,097个下调)(图3A)。这些DET主要富集于糖尿病并发症中肌动蛋白细胞骨架调控途径和AGE-RAGE信号通路(图3B),大多与钙离子结合和肌动蛋白丝结合功能有关(图3C)。其中一些DET在Post-GC中表现出不同的表达模式。例如,ANXA6.t1在Post-GC中上调,而ANXA6.t4在Post-GC中下调(图4)。

 

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图3 Pre-GCs和Post-GCs间DETs的分析

 

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图4同一基因的不同转录本在Post-GCs中表现出不同的表达模式

 

4、 Pre-GCs和Post-GCs间基因的表达差异

和Pre-GCs相比,Post-GCs中鉴定出2436个差异表达基因(DEG)(964个上调,1472个下调)(图5A)。这些DEGs主要富集在细胞因子受体相互作用通路和ECM受体相互作用通路(图5B), 大多与细胞外空间和细胞外区域功能相关(图5C)。同时鉴定到卵泡发育相关的DEGs,以及富含激素活性、细胞分化、胆固醇生物合成过程、类固醇激素受体活性和对环磷酸腺苷(cAMP)反应的DEGs(图6)。

 

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图5 Pre-GCs和Post-GCs间的DEGs分析

 

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图6 与激素活性、细胞分化、胆固醇生物合成过程、类固醇激素受体活性及cAMP反应相关的DEGs热图分析

 

5、 3个DHCR7转录本在Post-GCs中表达升高

Nanopore测序结果显示,DHCR7在Pre-GCs和Post-GCs中存在表达差异,3个DHCR7转录本在Post-GCs中的表达水平均显著升高。DHCR7富集于类固醇生物合成途径(图4B)。这三个DHCR7转录本的序列具有相同的编码区,但具有不同的5个UTRs。5'RACE技术检测到T1和T3转录本。qRT-PCR检测的DHCR7 T1、T3、T4转录本在GCs前后的表达动态(图7),与转录组测序结果一致。

 

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图7 三种DHCR7转录本在GCs前后的表达

 

6、 Post-GCs中总胆固醇含量增加

由于DHCR7编码的蛋白可以催化7-脱氢胆固醇形成胆固醇,作者测量了鸡GCs中的总胆固醇含量,发现Post-GC中的总胆固醇含量显著更高(图8)。Post-GC中胆固醇水平的升高可能是由三种DHCR7转录物的表达增加引起的。

 

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图8 Pre-GCs和Post-GCs中总胆固醇的表达

 

7、 雌激素、孕激素和促卵泡激素(FSH)对Pre-GCs中DHCR7表达的影响

与哺乳动物在颗粒细胞中合成雌激素不同,性成熟的母鸡在分级前卵泡的膜细胞中合成雌激素。为了确定雌激素是否参与调控DHCR7的表达,分别用不同剂量的雌二醇、黄体酮和FSH处理Pre-GCs,发现雌二醇以剂量依赖的方式显著促进DHCR7转录本T1、T3和T4的表达(图9A)。黄体酮对DHCR7转录本的表达均无显著影响(图9B)。低浓度FSH促进三种DHCR7转录本的表达,而高浓度FSH则抑制它们的表达(图9C)。这些数据表明,雌激素、孕激素和FSH对DHCR7表达的影响是不同的。

 

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图9雌激素对Pre-GCs中DHCR7转录本表达的影响

 

研究结论

 

本研究利用Nanopore测序技术揭示了鸡卵泡选择过程中Pre-GCs和Post-GCs之间mRNA和lncRNA的表达差异,并分析了Pre-GCs中DHCR7的表达调控,结果表明雌激素显著促进DHCR7三种转录本的表达。本研究结果可为更好地了解卵泡选择相关基因提供参考,为探索影响鸡卵泡选择效率的因素提供理论依据。

 


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