高通量的cDNA测序技术已广泛应用于转录组研究，大部分依赖于cDNA的测序技术限制了对RNA修饰的检测，而RNA修饰是重要的基因转录后调控因子。该研究基于Nanopore平台对水稻6个不同组织进行DRS测序，鉴定到45707个全长转录本，实现了对同一基因不同isoform的定量和差异分析。鉴定了各转录本的m6A和m5C RNA修饰位点，m6A和m5C均表现出组织特异性。被m6A修饰的转录本也倾向于被m5C修饰，RNA修饰与转录本表达以及Poly(A)尾长短都有很强的相关性。m6A和m5C修饰的转录本参与多个核心代谢通路。且大部分m6A和m5C修饰位点分布于先前研究的QTL内，表明这些位点有重要的功能。该研究将为水稻功能基因组和表观转录组研究提供支撑。

文章题目：Identifying RNA Modifications by Direct RNA Sequencing Reveals Complexity of Epitranscriptomic Dynamics in Rice

发表期刊：Genomics, Proteomics & Bioinformatics（IF=6.409）

发表时间：2023.2.11

作者单位：湖北大学

AG代理基因提供的服务：DRS测序分析

1. 通过DRS分析水稻动态转录组

该研究使用ONT DRS分析了2周龄幼苗的叶、根和茎，未开放花蕾的雌蕊和雄蕊，以及成熟种子的胚，共6种组织，每种组织各2个重复。共产生了超过70Gb数据和9400万条reads。每个组织两个重复之间的Pearson相关系数在99%以上（图1A）。

图1 水稻不同组织的 DRS 数据概述

在6个组织中共鉴定出45707个表达的转录本，对应于34768个基因（图1C）。鉴定到7257个新 isoforms和 755个新基因（图1C），其中1756个新 isoforms存在内含子保留。并通过PCR验证了其中4个新基因和5个新isoforms。

图2 DRS 鉴定的新基因和新转录本的验证

2. DRS鉴定基因和转录本表达的组织特异性

比较分析发现，约48.8%（16955）的基因和37.9%（18495）的isoforms在所有6个组织中普遍表达，表明基因及isoforms的表达具有组织特异性。不同比较组中DEG和DEI数量不同（图3C）。随机选择一个基因LOC_Os01g48990，分析其转录本表达的组织特异性。结果显示，LOC_Os01g48990.1在叶、根和茎中表达，而LOC_Os01 g48990.2在胚、雌蕊和雄蕊中表达（图3D）。

图3 6种组织中基因和转录本的表达分析

3. 转录本上的 m6A 和 m5C 修饰以common 和specific方式发生

共鉴定到28059个转录本含有81722个m6A修饰位点，每个组织中的修饰位点数量不同（图4A）。一部分转录本显示出m6A修饰的组织特异性（图4C）。m6A修饰位点主要分布在CDS区，并在终止密码子前达到峰值（图4E）。大约40%的m6A motif为GGACA，而其他3种motif（AGACT、GGACC和GGACT）也具有相当大的比例。

图4 水稻组织转录本中 m6A 修饰的特征分析

共鉴定到25869个转录本含有338907个m5C修饰位点，每个组织中的修饰位点数量不同（图5A）。m5C修饰位点主要分布在CDS区域，并在终止密码子前达到峰值（图5D）。同时分析了8种m5C甲基化酶基因，大多数在6个组织中都有高表达（图5F）。

对每个组织中具有m6A和m5C修饰的转录本进行比较分析发现，同时具有2种修饰的转录本数量占一半以上，且具有m5C修饰的转录本中有超过75%的转录本同时具有m6A修饰（图5G）。

4. M6A 、m5C 修饰与转录本的表达水平及Poly(A)尾长度的相关性

通过分析RNA修饰与转录本表达水平的相关性，结果显示，与未经修饰的转录本相比，含有修饰的转录本具有更高的表达水平和更短的Poly(A)尾。同时含有2种修饰的转录本或仅含m5C修饰的转录本的表达水平均高于仅含有m6A修饰或未经修饰的转录本（图6E）。表明，在促进转录本表达方面2种修饰没有明显的加性效应，m5C更有效。RNA修饰对Poly(A)尾长度的影响与其对表达水平的影响形成对比（图6F）。Poly(A)尾长度在所有组织中均表现出与转录本表达水平呈负相关（图6G）。

5. 修饰后的转录本参与中枢代谢途径，并表现出组织特异性

对m6A和/或m5C修饰的转录本进行GO分析，发现修饰的转录本广泛参与生物过程的各个方面，同时也存在一些组织特异性转录本（图7）。

图7 通过 AgriGO分析每个组织中特异性修饰的转录本

6. 大多数 m6A 和 m5C 修饰的基因位于数量性状基因座内

通过将m6A和m5C修饰的转录本与先前研究的QTL进行联合分析，结果表明，m5C和m6A位点在染色体上具有相似的分布，QTL密度较高的区域往往具有较高的RNA修饰（图8A）。每个组织中约75%的m5C和m6A修饰位点被定位在QTL区域（图8B）。此外，超过200个含m6A或m5C修饰的基因位于与30个农艺性状相关的QTL区域内，涉及多个生物学过程，包括发育、产量、肥力、开花以及生物和非生物胁迫（图8C），表明这些具有RNA修饰的基因可能决定水稻基因组中的重要农艺性状。

该研究基于DRS技术研究了水稻6个不同组织的RNA甲基化修饰，结果显示m6A和m5C均表现出组织特异性。被m6A修饰的转录本也倾向于被m5C修饰，RNA修饰与转录本表达以及poly(A)尾的长短都有很强的相关性。大部分m6A和m5C修饰位点分布于先前研究的QTL区域内，表明这些具有RNA修饰的基因可能决定水稻基因组中的重要农艺性状。该研究将为水稻功能基因组和表观转录组研究提供支撑。