文章题目：m6A RNA demethylase AtALKBH9B promotes mobilization of a heat-activated long terminal repeat retrotransposon in Arabidopsis

发表期刊：Science Advances

发表时间：2023.11

IF：13.6

通讯作者：Jungnam Cho (中国科学院分子植物科学卓越创新中心)

转座子作为一种DNA遗传元件，广泛分布于真核生物的基因组中，可在染色体中进行位置移动并改变其拷贝数，发生转座现象。转座如若不受控制，往往会影响基因功能发挥，造成基因组的不稳定性。正常情况下，转座子受到DNA甲基化和组蛋白修饰的抑制或沉默，而在环境胁迫下，转座子可被释放和激活，以增加遗传多样性和进化适应性。其中最为典型的便是拟南芥中Ty1/Copia类逆转座子Onsen逆转座子可在热激条件下被转录激活，并调控下游基因响应胁迫。

目前已有的研究大多关注甲基化在转录水平对拟南芥逆转座子Onsen的影响，而逆转座子Onsen对植物生长和发育的转录后修饰及调控的影响仍鲜有报道。近年来，m6A甲基化等转录后修饰成为植物科学领域的研究热点之一。本研究围绕m6A去甲基化酶AtALKBH9B对拟南芥中逆转座子Onsen 的转座调控机制，深入解析了RNA甲基化修饰调控植物响应胁迫过程的内在机理。

1.转座子Onsen含有m6A修饰并受m6A修饰调控

大量文献表明，在植物中，尽管热激胁迫可以显著激活转座子的转录，但是很少观察到转座发生。此前在人类有关的研究中发现m6A修饰参与逆转座子调控，由此推测植物中也可能存在类似机制。作者分析现有拟南芥花蕾热激胁迫处理后的m6A RIP-Seq数据，发现热激后m6A修饰在终止密码子附近分布密集，而在转录起始位点则分布较少（图1A），同时鉴定到多个仅在热激胁迫下存在m6A修饰的转录本（图1B），其中转座子占比较高（图1C）。通过对相应样本的转录组数据分析发现，转座子中含有m6A peaks较多的转录本占比更高，包括Onsen逆转座子家族（图1D）。表明，转座子RNA更易受到m6A修饰调控，并且m6A修饰可能参与转座子抑制。

Onsen作为热激胁迫下的逆转座子，可产生染色体外线性DNA（eclDNA）并插入基因组。m6A RIP-Seq数据表明热激下Onsen转录本的m6A修饰水平显著升高（图1E），并且在拟南芥基因组中Onsen家族均显著富集m6A（图1F）。作者对热激胁迫下拟南芥幼苗进行Direct RNA测序（DRS）验证，发现热激下Onsen转录本中确实存在m6A修饰，并通过对特定区域进行RIP-qPCR检测表明热激胁迫影响转座子的m6A修饰水平（图1G）。

图1：转座子Onsen含有m6A修饰并受其调控

2.m6A RNA去甲基化酶AtALKBH9B参与Onsen转录后调控

作者对现有热激胁迫后拟南芥转录组测序数据分析，推测RNA甲基化可能与热激胁迫响应有关，并从中选择AtALKBH9B基因做进一步的研究。已有研究表明AtALKBH9B参与植物中病毒RNA的去甲基化过程，由于转座子RNA与病毒RNA类似，推测AtALKBH9B也可能调节Onsen RNA。作者分别构建AtALKBH9B插入突变株和缺失突变株（图2A），发现在热激胁迫下，两种突变株的Onsen表达水平均显著上调（图2B），并且在转录组数据和GFP荧光标记实验中得到验证（图2C~D）。随后对热激胁迫下野生型和突变株进行RIP-qPCR检测m6A修饰水平，结果显示突变株中m6A修饰水平显著升高（图2 E~F），由此表明AtALKBH9B可能参与Onsen去甲基化过程。

图2：m6A RNA去甲基化酶AtALKBH9B参与Onsen转录后调控

3.AtALKBH9B的缺失影响Onsen转座效率

作者根据AtALKBH9B突变株中Onsen表达上调这一现象推测其转座效率也会有所提升，采用DNA (ALE)–qPCR检测发现，突变株中eclDNA表达水平显著下调（图3A），并且在热激胁迫下的突变株中也表现出表达水平下调（图3B）。进一步通过ddPCR鉴定可知，热激胁迫下突变株及其子代的Onsen拷贝数均显著降低（图3C~D）。以上可以表明AtALKBH9B缺失会影响Onsen转座效率，也由此推测m6A甲基化修饰确实抑制Onsen的转座发生。

图3：AtALKBH9B的缺失影响Onsen转座效率

4.热激胁迫下AtALKBH9B定位于SG中

应激颗粒（Stress Granules, SGs）是一种动态无膜细胞器，可在应激胁迫下形成并结合RNA和蛋白。此前研究表明在人类中RNA甲基化与SG有关，因此推测AtALKBH9B突变株中高甲基化的Onsen转录本可能定位于SG中。作者将AtALKBH9B与SGS3转入烟草叶片和拟南芥植株中进行共表达定位，发现AtALKBH9B可定位于SG中（图4A~C），并且会与ECT2等多个SG组分发生互作（图4D）。随后作者通过RNA斑点杂交实验和转录组测序尝试确定含有m6A修饰的RNA是否更倾向于定位SG中，发现突变株的SG中转录本的m6A修饰水平更高（图5A~B），并且富集SG的转录本含有更多的m6A peaks（图5C）；DRS测序也验证了该结果（图5D）。此外比较突变株中不同转录本的SG富集情况可知，突变株中Onsen 转录本显著富集于SG中（图5E~H）。以上结果间接表明在热激胁迫下，AtALKBH9B突变株中含有m6A甲基化修饰的Onsen转录本可被SG结合，进而影响其转座效率。

图4~5：热激胁迫下AtALKBH9B定位于SG中（左：图4，右：图5）

5.m6A甲基化抑制VLP组装和eclDNA产生

前述已经明确热激胁迫下含有m6A修饰的Onsen转录本定位于SG中，在去甲基化酶AtALKBH9B的促进下可发生转座。进一步通过荧光偏振和RNA免疫沉淀实验，发现含有m6A 修饰的Onsen转录本与蛋白GAG的结合能力显著降低（图6A）。同时，体外转录以及定量PCR结果显示含有m6A修饰的Onsen RNA的逆转录效率显著降低，影响了cDNA的产生（图6B）。表明，m6A修饰将抑制Onsen RNA参与类病毒颗粒（Virus like particle, VLP）的组装以及eclDNA的产生，最终导致Onsen转座效率降低。
 

图6：m6A甲基化抑制VLP组装和eclDNA产生

本研究结果表明定位于SG的AtALKBH9B可参与调控转座子Onsen RNA去甲基化过程，使其可从SG中释放，完成转座以响应胁迫，进而影响转座发生。总之，本研究揭示了m6A甲基化修饰在抑制转座过程中的作用，并深入解析了转座子如何通过宿主RNA去甲基化酶来对抗m6A介导的抑制机制，为后续转座子及RNA甲基化调控植物响应胁迫的机制研究提供了思路。
 

图7：m6A RNA去甲基化酶促进热激下逆转座子转座机制模型

参考文献：

Fan W, Wang L, Lei Z, et al. m6A RNA demethylase AtALKBH9B promotes mobilization of a heat-activated long terminal repeat retrotransposon in Arabidopsis[J]. Science Advances, 2023, 9(48): eadf3292.