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HR项目文章 | 黄芩T2T基因组组装及CYP450基因家族分析揭示了黄芩花青素的生物合成机制
文章题目：Gap-free genome assembly and CYP450 gene family analysis reveal the biosynthesis of anthocyanins in Scutellaria baicalensis
发表期刊：Horticulture Research
发表时间：2023.11
2023年11月《Horticulture Research》杂志发表了题为“Gap-free genome assembly and CYP450 gene family analysis reveal the biosynthesis of anthocyanins in Scutellaria baicalensis”的研究成果，上海辰山植物园为第一单位，裴天林博士和朱三明为论文共同第一作者，赵清研究员为通讯作者，研究助理崔孟颖为共同通讯作者。AG代理基因参与该项目PacBio HiFi、ONT超长和HIC测序及部分分析工作。
研究背景
黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)是一种多年生草本植物，具有悠久的药用历史。黄芩中含有丰富的黄酮类化合物，花青素属于类黄酮的一个亚类，负责花着色以及植物的生物/非生物抗性，黄芩花瓣呈现蓝色到紫色，是大量飞燕草素和矢车菊素类型花青素积累的结果，这两类花青素在B环都有3′-或3′5′-羟基。已知细胞色素P450基因(CYP450)在黄酮类化合物、萜类化合物和生物碱等特殊代谢产物的生物合成中起着至关重要的作用。在黄芩中，有几个CYP450基因已被进行功能探究，然而黄芩中CYP450家族和黄酮B环羟基化相关基因的研究尚未明确。
主要研究结果
1.黄芩T2T基因组组装
该研究使用Pacbio HiFi（∼103.96×）、ONT（∼65.99×）和Hi-C（∼98.71×）数据对黄芩进行基因组组装，最终得到黄芩gap-free基因组大小为384.59Mb，contig N50为42.44Mb，所有的contigs都锚定在9条假染色体上。作者通过对Hi-C热图互作信号、低基因密度区以及高LTR/Gypsy密度区相结合，在除Chr7外的每条染色体上都鉴定到一个潜在着丝粒区域。黄芩gap-free基因组BUSCO完整性评估为98.4%，QV值为43.6。最终注释到28,097个基因，重复序列比例为65.11%，其中串联重复序列占0.05%，最丰富的重复序列为LTRs，占基因组的26.08%。
图1 黄芩T2T gap-free基因组组装及基因组特征
2.比较基因组分析
该研究将黄芩T2T gap-free基因组与2019年发表的黄芩基因组进行共线性比对，发现T2T gap-free基因组中预测的端粒和着丝粒区域与旧版基因组无共线性（图2A），且新版本的基因组检测到更多的结构变异。作者对这些结构变异序列进行GO功能注释和KEGG通路富集分析显示，大多数功能富集在防御反应中。
图2黄芩T2T gap-free基因组与旧版基因组共线性比对
3.黄芩花中黄酮类化合物代谢组学分析
该研究通过靶向代谢组方法检测黄酮类代谢物的积累模式，结果发现黄芩花中含有498种黄酮类代谢物（图3A）。作者为了进一步分析花色相关代谢物，基于花青素的广靶代谢组技术，鉴定到飞燕草素和矢车菊素花青素是黄芩花组织中最主要的花青素（图3B）。
图3 黄芩花广靶代谢分析
4.黄芩类黄酮B环羟化酶基因的鉴定
作者通过对黄芩和拟南芥构建CYP450s的系统进化树，鉴定出7个类黄酮B环羟化酶候选物(SbFBH1-7)，属于CYP75亚家族（图4A）。利用SbFBH1-7和一些已报道的序列构建了系统发育树，结果表明，SbFBH7与葡萄中的F3′5′H(VvF3′5′H)同属CYP75A亚家族（图4B）。
该研究通过多序列比对分析，发现所有SbFBHs都具有CYP450保守结构域，底物识别位点6 (SRS6)为决定CYP450酶底物特异性的关键区域。结合已有研究，根据SbFBHs的SRS6基序第8位上氨基酸差异（图4D），表明SbFBH7是F3'5'H酶，而SbFBH1-6是F3'H酶，可能与黄芩中黄酮类化合物的3'或5'-羟基化有关。根据黄芩不同组织RNA-seq获得的FPKM值，作者发现SbFBH7在花蕾中的平均FPKM值明显高于SbFBH2和SbFBH5(图4C)，推测SbFBH7可能是黄芩花显色的关键酶。
图4黄芩和拟南芥CYP450系统发育树及SbFBH的系统发育树、多序列比对及表达模式
5.SbFBHs的功能表征
为了进一步分析酶的功能，研究人员将SbFBHs的全长ORF构建到表达载体并转化到酵母中，用不同底物对菌株进行发酵（图3）。发现二氢槲皮素和二氢杨梅素分别是矢车菊素型和飞燕素型花青素的前体，可能与黄芩花显色有关。该实验结果表明，SbFBH1、2和5是参与花青素合成的F3′Hs酶，SbFBH7是参与花青素合成的F3′5′H酶。
图5 SbFBHs的酵母酶活反应
总结
本文报道了黄芩第一个黄芩T2T gap-free基因组，对黄芩花中主要黄酮类化合物的鉴定和定量分析。此外，该研究对黄芩中CYP450基因家族进行了深入的分析，并对SbFBHs进行功能表征，确定了参与花青素合成的相关酶。该研究为唇形科物种进化研究提供了重要参考，同时为黄酮类化合物的B环羟基化以及蓝色花青素的生物合成提供了新的见解。
参考文献：
Tianlin Pei, et al. Gap-free genome assembly and CYP450 gene family analysis reveal the biosynthesis of anthocyanins in Scutellaria baicalensis, Hort. Res. 2023.
