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Q1、全长转录组测得是混样吗？如何分析差异呢？ 

回答：ONT全长转录组一般是单个样本进行建库测序的，差异转录本或差异基因是根据转录本/基因的reads 覆盖数通过TPM（每千碱基 reads 覆盖数（reads per million，RPK）计算得到的。ONT混样测通常多用于辅助基因组注释；PB全长转录组大多数混样测，但定量借助于这些样本的二代转录组数据。

Q2.我想了解一下一条真实的核苷酸序列在通过纳米孔的时候是只能测一次吗？就是数据量的产出只取决于上样量？ 

回答：核苷酸序列通过纳米孔的时候只能测一次；数据量的产出与很多因素有关，比如物种特异性、样品提取质量等；在公司进行提取的话，样本质量是有保证的，那么最大的差别就在于物种特异性，比如普通的动植物样本，产出大概60-70G/cell，但是水产类的样本产出相对较少。

Q3.目前mRNA上发现的修饰种类有多少？

回答：m5C，m6A，假尿苷，2'-O-甲基化等。

Q4.泛基因组和重测序数据在解决科学问题上有什么异同 

回答：泛基因组是构建一个可以包含种内遗传多样性的参考级别的基因组，泛基因组的构建有利于更多的遗传变异的检测。重测序，包括SNP和SV的重测序都是低深度的测序来获得遗传变异的标记，从而进行进化分析或者性状定位的分析。

Q5.如何判断样品质量或者不纯的方法？ 

回答：1)样品的外观性状是否含有异物；2)琼脂糖电泳检测是否样品有降解以及DNA 片段大小；3)Nanodrop 检测DNA 纯度；4)Qubit 精确地对DNA 进行定量OD260/OD280（DNA在1.8-2.0，RNA在1.75-2.0），

OD260/OD230（DNA在2.0+，RNA在1.8+），NC/QC比值越接近越好（0.95-1.2/1.5）

Q6.利用Nanopore技术测序，对于真菌基因组测序深度多少更好 

回答：一般推荐使用100X的Nanopore数据，加上80X的Illumina数据，进行真菌基因组的组装。加上3G的二代转录组测序进行基于转录组的基因序列注释。

Q7.如果做m6a修饰现在准确率怎么样，还需要meclip双重确认吗？

回答：DRS的m6A修饰准确度没有文献明确报道。m6A修饰验证有文章报道过，他们开发了一种名为Nanom6A的计算方法，用于XGBoost模型的纳米孔直接RNA测序，在单碱基分辨率下识别和定量m6A修饰，同时使用的MeRIP-Seq和m6A-REF-seq来验证新算法的准确性，验证结果高度一致。详见：

//genomebiology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13059-020-02241-7

Q8.现在Nanopore测序错误率是多少，鉴定SNP需要几条reads来共同判定？ 

回答：目前使用的R9芯片准确率是92%，R10芯片+Q20试剂准确率可以达到98%，目前还处于测试阶段。SNP检测不建议使用ONT。

 Q9.假如，重复样本的重复性比较差，测序数据还有意义吗？有什么较好的补救方法吗？

回答：重复性差会影响基因或转录本的差异定量结果，建议剔除重复性比较差的样本或者补测一个同组的重复样本。

Q10.鉴定SNP有什么推荐的建库方法？ 

回答：SNP检测，建议使用二代测序。

Q11.ultra-long的测序模式测序，对于端粒和着丝粒附近的SV检测灵敏度现在能做到什么水平啊，有相关的统计吗 ？

回答：目前关于端粒和着丝粒附近的SV检测还在研发过程，暂时没有相关统计。

Q12.call几十个样本间泛SVs，服务器计算太慢，可有更快获得泛SVs的方法？

回答：我们用的比较多的是sniffles和cutesv，速度还可以，老师可以试一下。

Q13.目前DNA甲基化测序是用WGBS多一些，还是ONT测序多一些呀？

回答：WGBS是甲基化检测已有的金标准，认可度较高；但是ONT甲基化是新的技术，具有对修饰信息直接检测、检测率高，多种甲基化修饰同时检测的优势，所以具有更好的前景。

Q14.请问一下测序完成之后会提供相应的分析软件吗，例如guppy之类的？

回答：分析报告中会提供所有使用的软件链接。

Q15.可以将三代测序的得到的去冗余GTF文件当做RNA-SEQ的基因注释gtf文件用么？然后在用二代的counts数据补充三代的么？

回答：理论上可行，但通常不这样做，同时发生多种剪切事件的转录本定量不准确。