根据最新估计，目前科学界已知的植物物种约有40万种。然而，其中有40%的物种因气候变化、栖息地消失和病害等因素正濒临灭绝¹。这在依赖少数物种的作物生产领域尤为紧迫。世界上90%的耕地仅种植了20种植物，彰显出人类面对气候变化和植物病害的潜在影响时的脆弱程度²。

植物的遗传表征可以用于识别有利于育种的特征。近年来，随着分子生物学技术的不断发展进步，越来越多的证据显示，除了点突变、小型插入缺失外，大片段的结构变异广泛存在于作物基因组内，且影响着许多重要的育种性状。本文中，我们将分享研究人员是如何通过纳米孔测序技术来对多倍体作物基因组及亚基因组中的结构变异进行分析，从而为植物保护和育种带来新的机遇。

甘蓝型油菜（Brassica napus）是世界范围内的主要油料作物，在烹饪、生物燃料和动物饲料中广泛使用。1.2 Gb甘蓝型油菜基因组是异源四倍体，其中一组染色体来自甘蓝（B. oleracea）（例如卷心菜，亚基因组C），另一组来自芜菁（B. rapa）（例如大头菜，亚基因组A）。这些基因组揭示了该生物体的进化史。

甘蓝型油菜基因组显示了广泛的基因层面和染色体层面的结构变异（SV），它们影响着重要的表型特征，例如开花时间、抗病性和种子质量。准确解析这些结构变异有助于改良这些重要的经济作物。

短读长测序技术已被用于描述许多结构变异。然而，由于该基因组为四倍体，以及短读长测序倾向于定位到一个以上的位点，使得亚基因组层面的变异解析极其困难。

为了更准确地解析甘蓝型油菜亚基因组层面的结构变异，尤斯图斯·李比希大学（Justus Liebig University）的研究人员利用纳米孔测序来进行研究。由于其读长较长，大大降低了序列比对到多个位置（即“多重映射”）的可能性^3,4。

该团队对取自世界各地的四种不同的甘蓝型油菜株系进行了测序，包括北美（N99，春季开花型）、中国（PAK85912，半冬季开花型）和欧洲（Express 617和R53，冬季开花型）。为了确保准确描述大片段的结构变异，研究人员进行了片段大小的筛选，以减少长度小于40 kb的DNA片段。在最近的测序中，还利用核酸酶清洗来尽可能提高孔的可用性，从而提高测序产出。这些测序在单个MinION测序芯片上产出了超过30Gb的数据，其中N50序列大约有40 kb。对所生成的测序数据使用NGMLR⁵与参考序列进行比对，然后使用Sniffles⁶算法识别结构变异。

该团队观察到，所有植物株系中的大多数结构变异长度在100-1000 bp之间，首席研究员Harmeet Singh Chawla 评论道，在短读长测序技术下“几乎不可能”检测到这种结构变异（图1a）。同样明显的是，与冬季开花基因型（R53和Express 617）相比，春季开花基因型（N99和PAK85912） 中检测到的结构变异片段更大（图1b）。

值得注意的是，在分析结果中发现5–8%的基因受到结构变异影响， 并且与A亚基因组相比，C亚基因组中观察到的结构变异多样性较低。Harmeet认为，这可能反映了作物的育种历史， 因为甘蓝（C亚基因组）的许多特征是经人工培育形成的， 而相对来说，大头菜（A亚基因组）几乎从未经过人工干预。通过检查已知与地理适应性有关的基因，该团队观察到了许多结构变异，包括在BnVIN3（一种与开花时间相关的基因）中，识别出90 bp的插入。值得注意的是，该插入只在两个冬季开花品系之一中发现，即Express 617。

研究还识别出与疾病抗性相关的结构变异，包括在R53株系的4-香豆酸:辅酶A连接酶基因中的725 bp的缺失图2）。Harmeet认为，这一变异解释了20%的轮枝菌（Verticillium，甘蓝型油菜的主要真菌病原体）抗性表型³。总之，该研究的研究人员认为，“目前，长读长测序技术的成本降低、读长准确性大幅提高、平均读长显著增加。因此，该技术不仅可以对复杂植物基因组进行准确组装，对全基因组重测序而言，也越来越成为一个可行的选择”⁴。

有关使用纳米孔长读长测序识别结构变异的更多信息， 请访问：

//nanoporetech.net/apps/investigations/structural-variation。

1. Royal Botanic Gardens Kew. 2020. State of the world’s plants and fungi. Available at: //www.kew.org/science/state-of-the-worlds-plantsand-fungi [Accessed: 07 December 2021]

2. Finkers, R. Know your onion —The impact of long reads on large genomes. Presentation. Available at:

//nanoporetech.com/resource-centre/know-your-onionimpact-long-reads-large-genomes [Accessed: 07 December 2021]

3. Chawla, H.S. Long reads reveal small-scale genome structural variations in allotetraploid canola. Presentation at London Calling 2019.

4. Chawla, H.S. et al. Long-read sequencing reveals widespread intragenic structural variants in a recent allopolyploid crop plant. Plant Biotechnol J. 19(2):240-250 (2021).

5. GitHub. NGMLR. Available at:

//github.com/philres/ngmlr [Accessed: 07 December 2021]

6. GitHub. Sniffles. Available at:

//github.com/fritzsedlazeck/Sniffles [Accessed: 07 December 2021]