摘要

（1）什么是T2T基因组；

（2）超长序列（N 50大于100Kb）等于T2T基因组

（3）获得超长序列（N50大于100Kb的序列）为什么这么难

（4）超长序列=AG代理基因的Super Long抽提试剂盒（+保护液）

（5）T2T基因组=100Kb序列=Super Long试剂盒

1.什么是T2T基因组

T2T基因组是指有一条或者多条染色体达到端粒到端粒（Telomere-to-Telomere）水平的基因组，T2T基因组完成图是基因组组装的终极目标。ONT超长序列（N50大于100Kb）可实现T2T基因组的组装，结合HiFi和二代数据，能够得到高质量的T2T基因组。

人类及多个物种的T2T基因组的发布，标志着基因组4.0时代正式到来。

2.超长序列（N 50大于100Kb）就等于T2T基因组

（1）基因组组装和Gap

短序列（二代PE150）和长序列（10-50Kb）结合已经可以把基因组组装得很好，结合HiC可以得到染色体级别的基因组。但是，通过此方法组装的染色体依旧是不完整的、碎片化的，中间存在很多Gap，基因组越复杂（高重复、高杂合、多倍体等）Gap数越多。

（2）超长序列（N 50大于100Kb）跨过Gap

由于有些基因组中Gap非常长（例：人的8号染色体有863kb的可变数目串联重复序列），普通的长读长测序（10-50Kb）也无法跨越。理论上当序列足够长的时候可以跨过所有Gap，把一个一个Gap给补充起来，达到一条染色体就是一条序列（Contig）的组装水平。

超长序列（N 50大于100Kb）可以轻松跨越这些Gap，实现真正意义上的T2T组装。

（3）着丝粒区域——Gap中的钉子户

着丝粒区域DNA一般是高度重复序列，重复次数可高达105次以上；着丝粒区域还可能存在散在重复序列；同时，着丝粒区域非常长（人的8号染色体有2.08Mb着丝粒α-卫星阵列）。超长序列（N 50大于100Kb）是解决钉子户的一大利器，可以把染色体的两条臂连起来。

（4）端粒区域——基因组装的痛

端粒区的DNA主要由高度重复序列组成，端粒序列没有得到完整组装，那么这条染色体还是不完整的。对于端粒延伸和完整组装的最好方法就是使用超长序列（N 50大于100Kb）。

T2T基因组组装示意图（方法一）

3.获得超长序列（N50大于100Kb的序列）为什么这么难？

（1）提取难

DNA提取是得到超长序列的第一步。一般认识中，完整的DNA电泳主带在23Kb的Marker线以上，很多抽提试剂盒或者是CTAB法都可以达到。但是要提取到完整的100Kb以上的序列，仅通过常规的提取方法无法实现。

（2）纯化难

DNA纯化是得到超长序列的第二步。纯化过程超长序列很容易断裂和被纯化掉，是获得超长序列的第二道坎，仅通过常规纯化方法无法得到DNA超长序列。

4.超长序列=AG代理基因的Super Long抽提试剂盒（+保护液） 

（1）提取环节

AG代理基因经过多年的研发推出了DNA抽提试剂盒Super-long DNA Isolation Mini Kit（3T）（Cat. No. ZY2203A01），可以提取更为完整的序列，主要有两种型号：

Super Long100（可以实现N50 100Kb以上DNA序列的提取）；

Super Long200（可以实现N50 150Kb-250Kb以上DNA序列的提取）。

（2）建库环节

AG代理基因独立研发研发推出特殊DNA保护液，保证建库和操作的过程中DNA不断裂，最后测得完整的序列，保护液不仅可以用于DNA提取还可以确保纯化和建库的过程中的DNA不断裂。

（3）项目经验

丰富的项目经验可以得到更好的实验结果。AG代理基因完成了13316张芯片（截止到2022年3月15日）长读长序列的建库和测序，其中3216张芯片的超长序列的建库和测序经验，确保各类样品都可以得到超长序列。

（4）项目实例：

5. 总结，T2T基因组=100Kb序列=Super Long试剂盒

超长序列扩跨过Gap，可以跨越着丝粒，可以组装端粒。获得超长序列（N50大于100Kb的序列）是一件很有挑战的事情。AG代理基因研发的Super Long试剂盒结合项目经验可以得到超长序列。