T2T基因组，指通过ONT ultra-long N50>100Kb结合PacBio HiFi和二代数据进行混合组装，得到的有一条或者多条染色体达到端粒到端粒（Telomere-to-Telomere）的水平基因组，T2T基因组完成图是基因组组装的终极目标。

北京大学现代农业研究院张兴平研究员团队于6月22日在植物学领域高水平期刊Molecular Plant在线发表首个西瓜的T2T基因组，并构建EMS突变库，为西瓜的遗传学、基因组学和改良提供了重要的资源。

1.西瓜G42 T2T gap-free参考基因组

该研究选用西瓜优良近交系G42进行T2T参考基因组组装和EMS突变文库构建（图1C）。PacBio HiFi测序获得20.62G（~55.9×）数据，ONT ultra-long建库测序获得 21.08G（~57.1×）数据，使用Hifiasm对PacBio HiFi reads进行组装，利用NextDenovo组装ONT数据，然后用gap-free的ONT基因组来填补HiFi组装基因组的gap区域。

组装得到的结果命名为G42pku，包含11条染色体，总长度为369 Mb。利用7碱基端粒重复序列（5‘端cccattt和3’端tttaggg）作为序列查询，鉴定了22个端粒，并构建了11个T2T染色体假分子，完成西瓜首个T2T gap-free基因组组装。利用Tandem Repeats Finder和hmmer，该研究鉴定了一个具有5个候选着丝粒串联重复序列，并预估了11个着丝粒区域的位置，长度从0.44Mb到3.31Mb。

图1 西瓜G42的gap-free参考基因组

2.G42和97103v2基因组的全局比较

G42基因组组装比97103v2组装具有更高的完整性和准确性，在G42基因组中检测到了11个着丝粒和22个端粒，而97103v2组装中没有捕获到任何端粒。对于97103v2组装中含有的220个gaps，而G42的组装填补了所有gap（图2B），BUSCO为99.13%。

图2 G42西瓜T2T gap-free参考基因组

3.G42 EMS突变文库的表型和遗传学评价

该研究发现，西瓜各发育阶段均存在表型变异，并根据其主要表型，将这些突变体可分为14类（图3）。在植物发育过程中，鉴定出49个突变体的叶片形态、叶片颜色、植物结构等都发生了改变。西瓜的早衰和卷叶突变体（图3中的m5、m6）尚未见报道。然而，突变体文库的评价通常不能检测根系表型，但在本研究中鉴定到了两个根系发育异常的致死突变体（图3中的m15，m16）。

图3 G42 EMS突变群体的野生型和突变型表型

4.G42 EMS突变文库的全基因组特征分析

该研究为了分析EMS诱导突变的全基因组分布，对39个个体进行了重测序，其中包括7个野生型、20个M1和12个M2植株。在32个突变株中共鉴定出8039个突变，几乎在每条染色体上均匀分布(图4A)，平均突变频率为21.77个mutations /Mb。该研究构建的西瓜G42 EMS突变库，在本研究中产生了超过20万个M1种子/植株，包含足够的突变，基本覆盖了所有具有农艺重要性的功能基因。

图4 EMS诱导的G42西瓜M1和M2植株的全基因组特征分析

5.利用G42 gap-free基因组对两个被选择的突变体进行基因鉴定

M1群体中伸长果实突变体的平均果形指数为1.86，而野生型为1.18（图5A）。为了鉴定该突变，该研究对11株植物的与果实表型相关的ClG42_03g0164800进行了测序，包括3个野生型对照、3个球形野生型、2个椭圆形突变体和3个细长果实突变体。与G42 gap-free基因组的序列比对显示，在第3外显子的934bp处有一个非同义点突变（图5B）。碱基从G到A的突变导致了氨基酸从天冬氨酸到天冬酰胺的改变(图5C)，这是由EMS处理产生的主要类型的碱基转变。

图5  G42西瓜果实延长突变体表型及ClFS1基因突变检测

该研究组装了一个西瓜近交系G42的T2T gap-free基因组，其中包括所有22个端粒和11个着丝粒。利用花粉EMS诱变技术从近交系G42中获得了20多万颗M1种子，从M1和M2群体中确认了301个形态变化的突变体并进行了测序。Gap-free基因组及其EMS突变库为西瓜的遗传学、基因组学和改良提供了重要的资源。

参考文献：//doi.org/10.1016/j.molp.2022.06.010

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