近日，江苏大学生物质能源研究所联合江苏大学环境与安全工程学院在期刊New Biotechnology（IF=6.490/Q1）在线发表“Comparative genomics reveals the organic acid biosynthesis metabolic pathways among five lactic acid bacterial species isolated from fermented vegetables”研究论文，该研究揭示了发酵蔬菜中5种乳酸菌的有机酸生物合成代谢途径，为其在工业发酵上的应用奠定基础。AG代理基因承担了该研究中的乳酸菌全基因组的测序和部分分析工作。

乳酸菌(LAB)是自然界中广泛分布的一类重要的需氧或兼性厌氧、革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性微生物。由于它们具有不同的功能特性，例如产生各种糖、次级代谢物和有益的有机酸，因此它们被认为是工业发酵中的生物防腐剂，可以防止发酵过程中病原体的生长。探索发酵食品中的 LAB 物种可能会揭示具有不同功能特性的新菌株。然而，构成 LAB 物种不同基因组属性的分子机制仍不清楚。

在本研究中，5种 LAB 物种从发酵蔬菜中分离出来，用于分析一般基因组特征、功能注释、转录因子和次生代谢物生物合成基因簇，以识别具有不同功能特性的特有/共有基因。并对有机酸生物合成代谢途径进行了重构，以识别乳酸菌和这些物种独有或共有的其他有机酸的关键基因和酶。

1. 实验材料

从发酵蔬菜表中分离出5种具有高产有机酸生产能力的乳酸菌株，分别为植物乳杆菌 PC1-1、戊糖片球菌 PC2-1(F2)、希腊魏斯氏菌 PC1A、布氏乳杆菌 PC-C1 和肠球菌 YC2-6

2. 基因组测序平台

Illumina NovaSeq 5000和Nanopore PromethION

3. 生物信息学分析

基因组组装注释、系统发育树、比较基因组分析、次级代谢物生物合成基因簇分析

1. 基因组特征

对5个LAB物种的基因组特征进行统计，结果显示植物乳杆菌PC1-1和肠球菌YC2-6中不存在前噬菌体，预测的CRISPR序列仅存在于希腊魏斯氏菌PC1A和布氏乳杆菌PC-C1中。5个LAB物种包含3个碳水化合物活性酶家族，最丰富的为GH家族，只有希腊魏斯氏菌 PC1A含有CE基因。系统发育树揭示了主要植根于分支的各种LAB物种之间的关系（图1）。

图1 5个LAB物种的全基因组序列与其他近缘物种的系统发育关系

2. 基因功能的比较和基因产物的同源分类

图2a和b显示5个LAB物种共有27个直系同源基因簇和28个基因功能。最多的基因被指定为碳水化合物代谢，GO和COG注释显示了参与有机酸生物合成、碳水化合物转运和次生代谢物生物合成的基因数目。植物乳杆菌PC1-1基因组含有最多数量的有机酸生物合成基因，而肠球菌属YC2-6基因组包含最多参与碳水化合物转运的基因。已知LAB中转运蛋白的多样性与利用其环境中的营养源的能力有关。

3. 基因组共线性和基因顺序保守性

共线性分析确定了8个特定长度的局部共线区块（图3）。布氏乳杆菌PC-C1、希腊魏斯氏菌PC1A、戊糖片球菌PC2-1(F2)和肠球菌YC2-6中倒位的总和随着相对染色体重排而扩大。此外，植物乳杆菌PC1-1和布氏乳杆菌PC-C1比其他物种具有更多的成对系统发育匹配。与其他物种相比，植物乳杆菌PC1-1和希腊魏斯氏菌 PC1A之间存在明显差异。所有LAB物种都表现出明显不同的基因组排列，进一步促进了它们在基因顺序内的保守性。

 图3 5个LAB物种之间基因顺序保守性的共线性图

4. LAB物种的有机酸生物合成代谢途径分析

图4显示了5个物种参与有机酸生物合成的相应基因和酶的异同。5个LAB基因组包含各种相似的基因，包括编码 α-乙酰乳酸脱羧酶的alsD、budA和aldC基因，其他相似基因包括zwf、rpiA、pyk和lacZ等。它们的存在表明这些物种通过糖的转化进行有益的有机酸生物合成。此外，植物乳杆菌PC1-1和布氏乳杆菌PC-C1基因组分别包含参与TCA 循环和天冬氨酸分解代谢的替代途径的fum和aspA。植物乳杆菌PC1-1和希腊魏斯氏菌PC1A基因组分别包含编码丙酮酸脱氢酶E2组分和乙醇脱氢酶的DLAT（aceF，pdhC）和Adh 基因。植物乳杆菌PC1-1基因组还分别包含编码磷酸乙酰转移酶和L-丝氨酸脱水酶的Pta和sdaC，它们在LAB的生物防腐性能中发挥重要作用催化有益代谢物的产生。因此，植物乳杆菌PC1-1基因组被证明含有参与有益有机酸生物合成的各种基因。

图 4 5种LAB的有机酸生物合成代谢途径

5. 参与乳酸菌有机酸生物合成的转录因子的预测

在这项研究中确定了几个具有称为环AMP受体蛋白（CRP）的独特转录因子，由5个LAB基因组共享（图 5a）。当葡萄糖水平低时，CRP通过激活乳糖操纵子的转录来充当葡萄糖传感器。总体而言，CRP包含与这5个LAB物种的结合位点。与特定位点结合的转录因子是转录调控的核心机制，图5b显示了CRP 结合位点的核苷酸位置频率和序列标志 (SeqLogo) (图 5b)。操纵子序列 SeqLogo构建显示出对5种LAB物种的各种CRP转录结合位点特异的高度保守基序。

图 5 (a) 五个 LAB 基因组中转录因子数量；(b) 五个 LAB 物种中预测的 CRP 转录因子结合位点的序列标识

6. 次生代谢物生物合成基因簇

在5个LAB基因组中预测到了7种次级代谢物BGC，包括非核糖体肽 (NRPS)、III 型聚酮化合物合酶 (T3PKS)和核糖体合成和翻译后修饰肽 (RiPP )等。这5个基因组包含具有独特核心生物合成基因mvaS的T3PKS（图 6）。此外，植物乳杆菌PC1-1和肠球菌属YC2-6分别含有编码碳酸氢盐转运系统渗透酶和内膜ABC转运蛋白渗透酶的转运蛋白相关基因，而布氏乳杆菌 PC-C1、希腊魏斯氏菌 PC1A 和肠球菌YC2-6含有调节基因（图 6）。这支持了转运蛋白和酶的动态相互作用导致形成功能性膜转运系统的理论，该系统将外部底物直接输送到细胞代谢中。

图 6  T3PKS 生物合成基因簇的比较

本研究报告了5种LAB的不同遗传功能和有益有机酸生物合成的全基因组信息。有机酸生物合成代谢途径丰富，具有不同发酵能力的特有和共有基因。此外，这5个基因组包含独特的核心次生代谢物生物合成基因簇和一个具有参与有机酸代谢的新结合位点的CRP转录因子。这些发现提示了这些乳酸菌在工业发酵方面的发展潜能。

参考文献

Cooab, C , et al. Comparative genomics reveals the organic acid biosynthesis metabolic pathways among five lactic acid bacterial species isolated from fermented vegetables, New Biotechnology (2022)