2022年7月16日，江苏省农业科学院休闲农业研究所邓衍明团队以“Comparative physiology and transcriptome analysis reveals that chloroplast development infuences silver-white leaf color formation in Hydrangea macrophylla var. maculata”为题的研究论文在期刊“BMC Plant Biology”上在线发表，该研究解析了银边绣球花叶片成色的分子机理。AG代理基因在本研究中承担了转录组测序及分析工作。

银边绣球花（YB）是一种优良的植物品种，具有美丽的花朵和银白色的边缘叶片。但对其叶片颜色特征及颜色形成机制的研究报道较少。

本研究比较了YB和从YB中获得的全绿叶突变体(YM)在表型、生理和转录组上的差异。结果表明，YB和YM具有相似的遗传背景，但YB光合作用减弱。转录组分析发现YB和YM之间有7023个差异表达基因。YB和YM在光合作用、叶绿体发育和分裂有关的基因表达量不同。本研究为深入研究绣球花叶片成色的分子机制提供新的思路。

本研究以银边绣球花（YB）和从银边绣球花中所获得的全绿叶突变体（YM）为材料，取YB和YM单株第4片叶片的边缘叶片，每个品系制备3个生物重复样本，进行illumina RNA-seq测序。

1. 表型和与序列相关的扩增多态性(SRAP)分析

从YB中获得一个全绿叶突变体(YM)(图1A)。经过多年的无性繁殖，YM的全绿叶稳定，开花正常(图1E-G)。

图1 银边绣球花的表型

2. 光合作用和光合色素含量

比较分析YB和YM的净光合速率(Pn)和气孔导度(Gs)值，细胞间CO2浓度(Ci)值以及蒸腾速率(Tr)值，结果表明，YB和YM的光合能力存在差异，且YM的光合能力高于YB(图2A-D)。

图2 银边绣球的光合参数

YB和YM的叶绿素和类胡萝卜素含量差异显著(图3)。叶绿素a、叶绿素b和叶绿素a+b含量在YM叶片的中心位置最高，而它们的含量在YB叶片的边缘位置最低。YB和YM叶片中心位置类胡萝卜素含量最高，YB叶片边缘类胡萝卜素含量最低。结果表明，YB叶片颜色异常与色素含量变化密切相关。

图3 YB和其全绿叶突变体YM的光合色素含量

3.叶绿体超微结构

通过叶绿体超微结构分析，验证了YB叶肉细胞中叶绿体的异常发育。YB和YM叶绿体的形状、大小和数量明显不同(图4)。YM叶绿体具有完整的间质类囊体结构，而YB叶绿体中没有间质类囊体结构（图4B，C)。YM叶绿体的形状为椭圆形或卵球形(图4D)， YB叶绿体的形状为肿胀的扁圆形或球形(图4A)。YM叶肉细胞的叶绿体中含有小的淀粉颗粒和亲锇小球(图4E, F)，而YB的叶绿体中淀粉颗粒较大，亲锇小球较多(图4B, C)。结果表明YB叶片叶绿体的超微结构不规则，证实了叶绿体发育异常。

图4 YB和 YM叶绿体超微结构

4. 测序技术和组装

根据以上表型和生理特征，推测YM植物中涉及叶绿体发育、分裂和色素代谢的基因表达模式发生了改变。为了验证这一假设，收集YB和YM的叶片边缘并进行转录组测序，以研究叶片颜色形成的机制。通过de novo（从头测序）组装，从绣球花转录组中共获得123122条unigenes（功能基因）, N50长度为1235 bp(表1)。这些unigenes平均长度为778 bp，中位长度为453 bp，最小长度为201 bp，最大长度为15890 bp，总长度为95,817,440 bp。unigenes的GC含量为38.98%(表1)。

表1 绣球花转录组中unigenes序列的统计

5. 差异表达基因(DEGs)及功能分析

在YB和YM叶片中分别有9008(8.12%)和12382(11.15%)个unigenes特异表达，89618(80.73%)个unigenes在YB和YM叶片中共表达(图5A)。以YM中基因的表达为对照，鉴定YB和YM之间的差异基因(DEGs)。共有7023个基因的基因表达水平发生了至少2倍的变化，其中4254个基因表达上调，2769个基因表达下调(图5B)。在YB和YM之间分别检测到10个最显著上调和下调的基因(图5C)。这些基因可能与叶片颜色的形成有关。

图5 YB和YM的基因数量和差异表达基因

与YM相比，YB的光合作用、叶绿素a/b结合蛋白l、ATP合酶和细胞色素基因表达水平下调(表2)，进一步证实了YM的光合作用高于YB。

表2 绣球花转录组中与光合作用相关的差异表达基因

6. 叶绿体发育、分裂及叶绿素合成降解相关基因分析

基于绣球花的转录组数据，鉴定了参与叶绿体发育、分裂和叶绿素生物合成降解的unigenes(表3)。与YM相比，YB中DELLA、PPR、GLK和Thf1(叶绿体发育)和FtsZ、MinD和AP2/ERF(叶绿体分裂)的表达水平下调，ARFs(叶绿体发育)的表达水平上调(表3)。YB与YM之间参与叶绿素合成和降解的unigenes表达谱没有显著变化(表3)。结果表明YB的叶片颜色可能是由叶绿体发育和分裂基因表达谱的变化引起的。

7. 利用qRT-PCR验证DEGs

为了验证转录组数据的可靠性，我们对样品中显著表达的基因进行了qRT-PCR (图6)，其表达趋势与RNA-Seq数据估计的转录丰度基本一致，但选择的基因呈现不同的fold-change values(差异倍数) (图6和表3)，这些结果证实了转录组数据的可靠性。

图6 qRT-PCR对YB和YM叶绿体发育和分裂相关基因的验证

综上所述，与YM相比，YB光合作用和色素含量降低，叶绿体发育和分裂相关的许多基因表达水平发生变化。这些结果表明，与叶绿体发育和分裂相关的基因表达模式的改变是导致YB叶边缘呈银白色的原因之一。研究结果为进一步研究叶片颜色突变提供了依据。

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//doi.org/10.1186/s12870-022-03727-1