7月29日，浙江大学医学院附属邵逸夫医院基础医学科学部在期刊Pharmacological Research（IF=10.334/Q1）在线发表“Resveratrol suppressed microglia activation and promoted functional recovery of traumatic spinal cord via improving intestinal microbiota”研究论文，该研究揭示了白藜芦醇在脊髓损伤后促进神经功能恢复的作用机制。AG代理基因承担了该研究中的16S微生物多样性测序和部分分析工作。

脊髓损伤(SCI)是中枢神经系统创伤性疾病致残和死亡的主要原因。SCI可以改变肠道微生物区系，改变相应的代谢产物，进而影响SCI的预后。在病理生理过程中，SCI的预后主要与小胶质细胞诱导的促炎反应有关。近年来，人们惊奇地发现肠道微生物群可以影响小胶质细胞的激活，也有研究表明，肠道菌群失调参与了SCI的病理生理过程。白藜芦醇是一种天然多酚，具有抗氧化、抗炎等作用，人体内先天免疫和适应性免疫都受到白藜芦醇的调节和修饰。多研究者发现在白藜芦醇治疗中肠道微生物群可能参与了各种疾病的预后。但目前还不清楚白藜芦醇的抗炎特性是否与肠道微生物群和代谢产物有关。因此，本研究中对这些问题进行了探讨。

1. 通过足迹分析法、压力痛阈和热痛阈测定对小鼠的运动协调性和感觉功能进行评估

2. 肠道菌群的16S rRNA基因测序和分析

3. 采用超高效液相色谱测定粪便中的SCFAS和BCFAS含量

4. 粪便微生物组收集和粪便微生物组移植(FMT)

5. BV2小胶质细胞体外实验

6. QPCR检测小胶质细胞、K型上皮细胞和小肠组织中的基因表达水平

7. 酶联免疫吸附法测定内毒素代谢产物LPS水平

1. 白藜芦醇可改善SCI后神经功能并减轻炎症反应、抑制小胶质细胞活化

将实验鼠分为3组(SHAM、SCI+VEH和SCI+RES）。行为学结果、损伤面积和神经元存活分析表明，白藜芦醇在35 dpi时显著促进SCI后神经功能的恢复。SCI的发生在早期伴有严重的炎症反应。选择7dpi作为感兴趣的时间点（图1A）。检测炎症相关细胞因子的水平，发现SCI+RES组中IL-6、MCP-1和TNF在SCI后3和7 dpi（图1C和1D）显著降低，IL-10水平在3dPI时降低，而在7dPI时升高。用免疫荧光法检测脊髓中IBA-1的表达（图1E)，结果发现，SCI+RES组IBA-1阳性面积和阳性细胞数较SCI+VEH组少（图1F)，说明在7dpi时，白藜芦醇能明显抑制SCI后小胶质细胞的活化。

图1 白藜芦醇可减轻小鼠脊髓损伤后的炎症反应，抑制小胶质细胞的活化

2. 白藜芦醇对SCI后肠道微生物组成的影响

Shannon指数在SCI+VEH组和SCI+RES组之间没有统计学差异（图2A）。Venn图证实SCI无论白藜芦醇治疗与否都提高了肠道微生物群的多样性和丰富度（图2B）。β多样性揭示了白藜芦醇可以改变微生物组组成（图2C和2D）。SCI+VEH组的微生物组中梭状芽孢杆菌的丰度增加，丹毒三头孢菌的丰度减少。而白藜芦醇治疗（图2E和2F）逆转了这些变化。有趣的是，SCI+RES组增加了乳酸杆菌和乳酸杆菌（图2E和2F）的相对丰度。这些结果表明SCI改变SCI后肠道微生物组成，而白藜芦醇可以逆转这种微生物组成。

图2 白藜芦醇改变小鼠脊髓损伤后肠道菌群组成

3. 微生物组成的改变减少了SCI后内毒素代谢产物的浸润

LEFSE分析证实SCI+VEH组的LPS产生菌为拟杆菌属、拟杆菌属、拟杆菌属、脱磺弧菌属等，而SCI+RES组的LPS产生菌较少，为肠杆菌属和肠杆菌科（图3A）。此外，枝状图分析进一步表明，在SCI+VEH组中，拟杆菌目、G_uncultured_bacterium_f_desulfovrionaceae和s_uncultured_bacterium_f_desulfovrionaceae等的丰度占显著优势（图3B）。收集结肠组织和血液样本，用ELISA法检测LBP（与LPS浓度一致）。显示在3 dpi时结肠和血清LPB水平无明显差异。但在7dpi时，结肠和血清中LPB浓度均有显著差异（图3C和3D）。表明，在脊髓损伤急性期，白藜芦醇可减轻LPS产生菌的作用、减少LPS向血液的浸润。

图3 白藜芦醇能减少小鼠脊髓损伤后产生LPS的细菌种类，降低LBP浓度

4. SCI后微生物组成的改变提高了丁酸含量

在所有肠道微生物代谢产物中，除了LPS外，SCFAs是最重要的抗炎分子。使用UPLC检测SCI后7dpi时粪便中SCFA的浓度。SCI+VEH组的丁酸浓度低于SHAM组，经白藜芦醇处理后7dpi时的丁酸浓度明显恢复。而白藜芦醇处理降低了异丁酸含量（图4B）。鉴于丁酸盐需要通过转运蛋白被小肠上皮细胞吸收到血液中，因此采集了7 dpi时体小肠组织和离体K型上皮细胞，用QPCR方法检测SCFA相关转运蛋白和受体的表达。结果表明，白藜芦醇在体内和体外均显著增强了SCFA相关转运体和受体的基因表达（图4C）。总的来说，SCI后白藜芦醇对肠道微生物组成的改变进一步改变了SCFA的剖面，特别是白藜芦醇处理增加了SCI后粪便中丁酸盐的含量。

图4 白藜芦醇改变小鼠脊髓损伤后的代谢物SCFAs和BCFAs

5. 改变微生物来源的代谢产物抑制小胶质细胞活化

将供体SCI+VEH、SCI+RES小鼠粪便的上清液分别转入CTRL+SV组、LPS+SV组和CTRL+SR组、LPS+SR组。用QPCR检测BV2小胶质细胞中促炎基因的表达。与LPS+SV组相比，LPS+SR组促炎性IL6、TNF和iNOS的mRNA表达明显下调。此外，还用IBA-1和iNOS免疫荧光来验证小胶质细胞的体外激活。结果发现，LPS+SR组中IBA-1和iNOS的平均荧光强度明显低于LPS+SV组（图5C和5D）。

用单一代谢产物丁酸盐处理BV2小胶质细胞，观察其对小胶质细胞活化的抑制作用是否与粪便上清相似。如图5E所示，QPCR结果进一步证实，与LPS+VEH组相比，LPS+BUT组促炎基因IL6、TNF和iNOS下调。这些数据表明，白藜芦醇改变的微生物源代谢物抑制了小胶质细胞的活化，丁酸盐可能起着抑制小胶质细胞活化的主要作用。

图5 白藜芦醇处理的粪便上清液抑制小胶质细胞活化

6. 微生物组改变促进SCI后神经功能恢复

与接受SCI+VEH组的SCI+FV组相比，接受SCI+RES组肠道微生物群的SCI+FR组在行为学测试中显示出良好的预后。BMS评分和甩尾潜伏期试验在7 dpi时显示有统计学意义（图6B），表明肠道微生物群参与了白藜芦醇介导的神经保护作用。后检查FMT组在7 dpi时SCI后脊髓中炎症相关细胞因子的分布。SCI+RES组的FMT降低了促炎细胞因子IL-6、MCP-1和TNF的水平，同时升高了抗炎细胞因子IL-10的水平。这些结果表明，白藜芦醇介导的小肠微生物区系改变对脊髓损伤有抗炎作用。

免疫荧光法观察脊髓损伤后7dpi时IBA-1的表达。SCI+FR组激活的小胶质细胞的阳性面积和阳性细胞数明显低于SCI+FV组（图6E和6F)，说明在7dpi时，白藜芦醇介导的肠道微生物区系改变明显抑制了SCI后小胶质细胞的激活。用Pearson相关分析法检测粪便中丁酸或异丁酸浓度与免疫荧光IBA-1表达阳性面积和阳性细胞数的相关性。结果表明，粪便中丁酸盐浓度与IBA-1阳性面积和阳性细胞数呈负相关。相反，异丁酸与IBA-1阳性面积和阳性细胞数（图6G)呈正相关。表明，丁酸和异丁酸可能是小胶质细胞介导的炎症消退的关键因素。

图6 小鼠脊髓损伤后肠道菌群介导白藜芦醇抗炎作用

综上所述，白藜芦醇通过改善SCI小鼠小肠生物失调，降低LBP含量，提高小肠代谢产物丁酸盐的含量，进而抑制脊髓小胶质细胞活化，促进SCI小鼠运动和感觉功能的恢复。

参考文献

Ning He , et al. Resveratrol suppresses microglial activation and promotes functional recovery of traumatic spinal cord via improving intestinal microbiota, Pharmacological Research (2022).