2022年9月19日，中国中医科学院中药研究所青蒿素中心以“Integrated multi-omics analysis and microbial recombinant protein system reveal hydroxylation and glycosylation  involving nevadensin biosynthesis in Lysionotus pauciforus”为题的研究论文在期刊“Microbial Cell Factories”上在线发表，该研究阐明了吊石苣苔石吊兰素生物合成的羟基化和糖基化机理。AG代理基因承担了该研究中PacBio 3+2全长转录组和广泛靶向代谢组的检测和分析工作。

吊石苣苔可积累特殊次生代谢物，以适应干旱和高盐地区的生存。石吊兰素是吊石苣苔的主要活性成分，而黄酮骨架的羟基化和糖基化等复杂修饰决定了石吊兰素的多样性和生物活性。组学数据的缺乏限制了对次生代谢物质积累模式和生物合成途径的探索。本研究整合了转录组学、代谢组学和微生物重组蛋白系统，揭示了在吊石苣苔中石吊兰素生物合成的羟基化和糖基化过程。

本研究以贵州西南自治州安龙县采集的吊石苣苔为材料，取同一植株的根、茎、叶和花，每个组织制备三个生物重复样本，进行广泛靶向代谢物的检测和PacBio全长转录组测序。

1.代谢组分析表明吊石苣苔中富含黄酮苷类化合物

为了研究吊石苣苔在根、茎、叶和花中的积累模式，通过UPLC-MS/MS分析鉴定了次生代谢物（图1a）。黄酮类化合物为主要代谢物，在根、茎、叶和花中共有235种黄酮类化合物（图1b）。将花中黄酮类化合物与根、茎和叶中的黄酮类化合物进行比较（图1c），结果表明花可能是研究吊石苣苔类黄酮生物合成的最佳组织。此外，还发现山奈糖苷在花中积累，而4种石吊兰素糖苷在根、茎和叶中更为丰富（图1d）。

图1 吊石苣苔广泛靶向代谢组分析

2.吊石苣苔中石吊兰素生物合成相关基因的表达模式

为了进一步探索吊石苣苔中石吊兰素生物合成途径，本研究使用叶、根、茎与花等组织进行PacBio 3+2全长转录组测序分析，结合代谢组中的代谢产物，绘制了参与苯丙素和类黄酮生物合成的预测途径，其中查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄酮合成酶（FNS）在花中的表达水平最高，与组织中柚皮素查尔酮、柚皮素和芹菜素的积累模式一致(图2a-b)。

由于石吊兰素及其糖苷化合物的结构形成主要有三个修饰步骤：1）由CYP450在A环6和8位羟基化，2）由O-甲基转移酶（OMT）进行多区域特异性O-甲基化，3）由O-糖基转移酶（OGT）进行O-糖苷化。因此，组织特异性黄酮分布模式对鉴定石吊兰素下游生物合成途径中的CYP450和UGTs具有参考价值。

图2 基于转录组数据的KEGG分析和推测的石吊兰素生物合成途径

3.酵母LpCYP450系统发育分析及LpF6/8H功能鉴定

LpCYP450系统发育分析显示，在吊石苣苔全长转录组数据中鉴定出4个CYP82D，其中2个（LpCYP82D-1和LpCYP82D-8）被鉴定为F8H和F6H基因（图3b-d）。与ObCYP82D33和MpCYP82D62不同的是，LpCYP82D-8 (F6H)可以羟基化黄酮，无论是否含有甲酰氧基残基(芹菜素等）。在系统进化树中，LpF6H位于SbCYP82D2、ObCYP82D33和MpCYP82D62之前，表明F6H的功能可能发生在这些物种的F8H之前，与黄芩属的进化相反。LpCYP82D-1 (F8H)与来自rieske型PAO家族的ObF8H具有类似的8-羟基化功能，但更倾向于芹菜素，而对含有a环取代甲氧基残基(4 ' -羟基黄酮)的黄酮没有活性。LpF6H和LpF8H的发现重建了吊石苣苔中不同于紫花罗勒的石吊兰素生物合成途径的起点。

图3 酵母中LpF6/8H的系统发育分析和酶促试验鉴定

4.大肠杆菌中LpUGTs的系统发育分析和Lp7OGT的功能鉴定

根据在基因C末端附近有显著的PSPG基序，且编码的蛋白质由300-600个氨基酸组成这样的标准，共筛选187个转录本。再通过比较4种组织中FPKM和所有基因的表达水平，筛选出13个LpUGT基因，并与之前的特征UGT基因构建系统进化树 (图4a)。随后以4种黄酮类化合物为糖受体，以UDP-葡萄糖或UDP-鼠李糖为糖供体进行酶学试验。结果表明，重组LpUGT95可以特异地以石吊兰素为底物，以UDP-葡萄糖或UDP-鼠李糖作为糖供体(图4b)。经UDP-葡萄糖处理的重组LpUGT95的提取物中检测到峰I和峰II(图4b)。经UDP-鼠李糖处理的重组LpUGT95的提取物中检测到峰III(图4b)。根据峰I、峰II和峰III的串联质谱分析(图4c)， LpUGT95酶可以被鉴定为石吊兰素5/7-O糖基转移酶，会定向的将糖苷转移到A环的7-OH。

图4 LpUGTs的区域选择性预测

代谢组学和全长转录组关联分析揭示了岩溶适应植物吊石苣苔次生代谢产物的积累模式和生物合成途径。此外，两个LpCYP82D成员和一个LpUGT的功能鉴定重建了石吊兰素的生物合成途径。