杜鹃花属（Rhododendron）的花朵颜色高度多样化，为花色研究提供了独特研究模型。该研究用ONT测序数据对黄花杜鹃R. molle进行了gapless基因组组装，选用黄花/红花杜鹃进行比较基因组分析，结合代谢组、时序基因共表达等分析，揭示了不同花色素沉着的特定基因调控变化机制，为杜鹃花属的遗传学和分子育种提供重要基础。

文章题目：Gapless genome assembly of azalea and multi-omics investigation into divergence between two species with distinct flower color

发表期刊： Horticulture Research（IF= 7.291）

发表时间：2022.10.26

1、R. molle的gapless基因组组装与注释

该研究使用51.97Gb（~100×）的ONT（Oxford Nanopore Technologies）测序数据，49.12 Gb的PCR-free Illumina数据，结合193.78 Gb的Hi-C数据进行R. molle染色体水平基因组组装。最终组装大小为653.46 Mb，获得了一个端粒到端粒的gapless基因组组装，染色体挂载率为99.48%，contig N50为44.85 Mb，BUSCO为93.4%，与已发表的多个杜鹃属植物基因组相比（表1），在连续性和完整性方面均有较大提升。

表1  9种杜鹃花植物的测序、组装和注释比较

R. molle的13条假染色体各有一个着丝粒，着丝粒长度从3 Mb到20 Mb不等。并且Gypsy LTRs优先富集在着丝粒区域，从着丝粒向染色体末端延伸，GC含量下降，基因密度增加（图1a）。通过对端粒特征motif进行检测，在组装的染色体上共检测到17个潜在的端粒区域。其中，chr07和08完全为gap-free组装，且检测出两端的端粒，即达到T2T（telomere to telomere）水平。全基因组中仅有6条染色体存在9个gaps，其中4个gaps位于chr11非常复杂的着丝粒区域（图1a）。

图1 R. simsii和R. molle的基因组比较

2、杜鹃的基因组差异和假基因化

共线性分析对R. simsii和R. molle基因组进行结构变异鉴定，除402,253,777 bp长的共线区（~占整个R. molle基因组的60%）外，有234,864,123 bp（~36%）是R. molle特有的，因此与参考基因组未对齐（图1b），这些无法对齐的区域是R. molle基因组中的LTR-RT富集区（图1a中a-e）。表明LTR-RTs可能导致了种间基因组的分化。有趣的是，作者发现大多数R. molle的特有序列（与R. simsii无法对齐的区域）都是潜在的着丝粒区域（图1a），表明这两个物种之间的着丝粒差异可能与物种分化相关。

LTR-RT和Gypsy的扩张与大量的基因复制和假基因化相关。与R. simsii相比，R. molle基因组中Gypsy的扩张主要是由于四个亚组的扩张：Retand、Ogre、Athila和Tekay（图1c）。该研究在R. molle中鉴定出26323个假基因和40023个编码基因，其数量远高于R. simsii（假基因8846个；编码基因32999个）（图1d）。在R. molle的编码基因和假基因中，散在重复（DSD）最多，有30839个（46.5%）。

3、代谢组和色素的生物合成

该研究重建了与R. molle和R. simsii花色形成有关的色素代谢途径（叶绿素、类胡萝卜素、花青素和黄酮醇等）（图2、3a）。

图2 R. molle类胡萝卜素和叶绿素的代谢途径和时序基因调控

作者比较了R. molle和R. simsii基因家族，发现15个花青素生物合成途径中有12个基因家族发生收缩，其收缩程度（80%）在R. molle的所有生物合成途径中最高（图3b）。在R. molle花青素合成的基因家族中也发现较多假基因，表明假基因化可能是导致该物种中观察到基因家族收缩的原因（图3c）。

图3 花青素生物合成基因的缺失导致了R. molle中缺少红色品种

在叶绿素和类胡萝卜素的代谢途径中，收缩的基因家族和假基因相对罕见（图3b，c）。由于黄酮醇与花青素有7个生物合成步骤（图3a），在黄酮醇途径中也发现了相当数量的假基因和收缩的基因家族（图3b，c）。图3d为类黄酮生物合成通路基因获得和缺失的示例。

4、不同杜鹃之间时序基因共表达的比较分析

该研究分别构建并比较了两种杜鹃花的时序基因共表达网络（TO-GCNs），研究了两种杜鹃花之间与花色变化相关的基因调控（图4）。

根据花色素沉着的表达模式，时序子网络可分为三个主要阶段：初期（T1-T2，L1-L3，花瓣仍为绿色）、中期（T3，L4，绿色到黄色过渡）和末期（T4-T5，L5-L7，黄色）（图4d）。

图4与黄花颜色相关的色素沉着变化和时序基因共表达网络

在检测物种特异基因数量时，两种杜鹃花的末期差异最为显著。两种杜鹃花在开花初期均表现出保守的共表达，包括239个转录因子和31个与色素生物合成相关的酶促基因（图5a）。在初期阶段，叶绿素生物合成基因是酶促基因中最丰富的类型，其次是类胡萝卜素生物合成基因、花青素生物合成基因和黄酮醇生物合成基因。在末期，两种杜鹃花之间的TO-GCNs的有限一致性（图5a）有助于物种特异性色素调控的鉴定。

进一步分析发现，类胡萝卜素、黄酮醇类胡萝卜素、黄酮醇生物合成基因在黄花R. molle中亚网络中被识别，而花青素生物合成基因位于红花R. simsii亚网络中被识别，进一步证实了代谢组研究结果。

图5 R. molle特异性TO-GCN末期色素代谢途径的子网络

在R.simsii特异性亚网络中，作者鉴定出19个主要产生花青素的酶基因，这些基因均在末期高水平表达（图6a），预测这些酶基因可能受到74个潜在调控因子的调控，主要是WRKY、ERF、WD40、C2H2和NAC家族成员。有意思的是，在R.simsii特异亚网络95个基因的103个假定的同源物与R. molle中LTR-RT插入显著相关（图6b，c）。

图6 R.simsii特异性TO-GCN末期色素代谢途径的子网络

作者进一步检测了hub gene F3oGT 和F3'H|F3'5'H（图6d）及其35个潜在调控因子（图6e）。发现F3oGT可能由C2H2和MYB_related共同调控；F3H|F3‘5’H可能由ERF，WRKY和ERF共同调控（图6f）。

该研究利用ONT数据，结合Illumina和HiC测序技术，组装了gapless的黄花杜鹃（R. molle）高质量基因组，多条染色体达到T2T水平。通过黄花/红花杜鹃的比较基因组分析，发现Gypsy扩张与基因组大小的增加及散在重复、假基因数量的增加相关。结合代谢组、时序基因共表达网络（TO-GCNs）和比较分析揭示了不同花色素沉着的特定基因调控变化机制。

本研究采用多组学策略，解开两种重要杜鹃花之间的花色差异机制，为进一步的功能遗传学和分子育种提供参考。

参考文献：

Shuai Nie, et al. Gapless genome assembly of azalea and multi-omics investigation into divergence between two species with distinct flower color. Horticulture Research, 2022.