编码蛋白质合成机制的5‘末端寡嘧啶（TOP）mRNA的翻译受到氨基酸传感mTOR途径的严格调控。然而，其调控机制仍然未知。

本研究通过直接RNA测序（dRNA-seq）等一系列实验证明LARP1有助于在氨基酸饥饿(AAS)下具有长poly（A）尾部的TOP mRNA的选择性积累，从而加速核糖体加载到TOP mRNAs上，以便在AAS后恢复翻译。

英文标题: mTOR- and LARP1-dependent regulation of TOP mRNA poly(A) tail and ribosome loading

发表时间：2022.10.25

发表期刊：Cell Reports

IF：9.995

雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是连接细胞代谢、mRNA翻译和最终细胞生长的营养传感通路的中心靶点。氨基酸可以诱导mTOR的激活，在转导mTOR活性改变的蛋白中，RNA binding蛋白LARP1在mTOR信号通路下游受严格调控的核糖体生物发生中起着至关重要的作用。这些LARP1功能在mTOR信号通路下游受到调控：当mTOR信号通路被AAS或mTORC抑制剂失活时，更多的TOP mRNA被LARP1结合，变得更加稳定，但翻译被抑制。

Poly(A)尾部代谢与基因表达密切相关。poly(A)尾部去除，称为去烯基化，是mRNA衰变的第一步和限速步骤，去烯基通常是被序列特异性RNA结合蛋白靶向以破坏mRNA的稳定性。相反，在一些种类丰富的mRNA中，去烯基化和mRNA降解可以解耦。然而，poly(A)长与翻译的解耦是否适用于所有种类的mRNA，是否有例外，LARP1介导的poly(A)尾长调控的意义可能是什么，目前尚不清楚。

材料：HEK293T细胞

主要研究策略：direct RNA sequencing、Northern blotting

1、 在富含氨基酸的条件下，TOP mRNA翻译与其poly(A)尾部长度呈正相关

为了研究poly(A)尾巴长度与翻译之间的相关性，研究者对细胞质提取物进行了多聚体分离，收集了4个馏分池，分别对应于游离(游离)、单体(单体)、轻多体(轻聚，2 - 4个结合核糖体)和重多体(重聚，5个以上结合核糖体)馏分(图1A)。使用帽结合蛋白GST-eIF4EK119A的高亲和力突变体从LiCl沉淀的总RNA中纯化5’帽mRNA，并进行基于dRNA-seq的poly(A)尾长分析，发现长poly(A)尾的密度在多体馏分中偏高（图1B）。

作者进一步找出poly(A)尾巴长度和核糖体密度之间呈现正相关的基因，GO分析表明，RP基因在正线性组中显著富集（图1D）。几乎所有的RP基因在其最末端都有5‘TOP序列。

图1在TOP基因中，翻译和poly(A)尾巴长度的耦合作用很明显

Northern印迹分析显示，具有长poly(A)尾的报告mRNA（3h）主要分布在重多聚体部分，并且随着去烯基化的进行（6和9h），报告mRNA的分布向较轻多体部分转移（图2C-D）。

图2 dRNA-seq结果的Northern印迹验证

2、 TOP mRNA的Poly(A)尾长度随着氨基酸可用性的变化而动态波动，这种波动依赖于LARP1

在mTOR活性/富含氨基酸的条件下，TOP mRNA翻译和poly(A)尾部长度之间的相关性可能表明TOP基因在转录后受poly（A）尾部长度调控。因此，作者首先通过northern印迹检测了长期AAS对RP mRNA poly(A)尾部长度的影响（图3A）。迁移速率较慢的RP mRNA在AAS期间开始不断积累，而在生长条件下迁移速度更快的RP mRNA逐渐减少（图3A）。通过寡聚（dT）/RNase H消化去除poly(A)尾部，在整个样品的相同位置呈现单个条带，表明迁移较慢是由于尾部延长（图3A）。这些mRNA的poly(A)尾部长度响应于氨基酸的可用性而动态调节，因为当参考饥饿细胞时，拉长的尾部再次缩短（图3B）。

图3 AAS条件下的Northern印迹分析

为了获得AAS或mTOR抑制条件下与LARP1 KD结合的poly(A)尾长度变化的全貌，研究者进行了DRS分析，发现TOP mRNA的poly(A)尾部在Torin1处理下以LARP1依赖性方式延长（图4）。表明TOP mRNA poly(A)尾部在AAS/mTOR抑制条件下选择性延长，LARP1对该过程至关重要。

图4 mTOR失活下TOP mRNA的选择性和LARP1依赖性尾部延长

3、 LARP1介导靶mRNA转录后聚腺苷酸化

为了探索LARP1如何诱导靶TOP mRNA的poly(A)尾部延长，我们采用了MS2系留系统。在HEK293T细胞中，与MS2外壳蛋白N端融合的LARP1与携带噬菌体MS2干环的报告mRNA共表达，并通过northern印迹法评估mRNA poly(A)尾部长度。LARP1的系带导致报告mRNA的迁移较慢（图5A-B）。当去烯基化被抑制时，poly(A)尾部变得更长，这表明LARP1系链引起的poly(A)尾部长度的变化不仅仅是由于去烯基的抑制。

进而监测转录关闭后的poly(A)尾部代谢，在去烯基化缺陷条件下（HA-Caf1 mt/Pan2 mt）的LARP1系链导致在转录关闭后出现更长的poly(A) 尾mRNA，表明 poly(A)尾伸长发生在转录后，额外的转录追逐实验（图5H-I）结果说明LARP1诱导靶mRNA的转录后聚腺苷酸化。

图5 LARP1转录后延长mRNA poly(A)尾部

4、 LARP1通过其N末端区域与非标准poly(A)聚合酶结合

最后，我们研究了LARP1是否与poly(A)聚合酶（PAP）发生物理相互作用。53FLAGLARP1过表达下的共免疫沉淀（coIP）实验揭示了PAPD4、PAPD5和PAPD7与LARP1的RNase抗性相互作用（图6A），PAPD4、PAPD5和PAPD7优先与LARP1的N端半部（1–495 aa）结合（图6C），这在与mRNA连接时触发poly(A)尾部伸长。

图6 LARP1与非典型poly(A)聚合酶PAPD4、PAPD5和PAPD7的RNase抗性相互作用

本研究证明了在mTOR活性/富含氨基酸的条件下，TOP mRNA翻译与其poly(A)尾部长度呈正相关，这表明TOP mRNAs在转录后受poly(A)尾部长度调控。TOP mRNA的尾部长度随着氨基酸的可用性而动态波动。Poly(A)尾部在mTOR活性/富含氨基酸的条件下缩短，而长尾TOP mRNA在mTOR-非活性/氨基酸缺乏（AAS）条件下积累。一种RNA结合蛋白LARP1对该过程是必不可少的。LARP1与非标准poly(A)聚合酶相互作用，并诱导靶向的转录后聚腺苷酸化。