文章题目：Comprehensive profiling of epigenetic modifications in fast-growing moso bamboo shoots

发表期刊：Plant Physiology

IF：8.005

发表时间：2022.11.23

1.毛竹速生伴随着明显的形态变化

通过毛竹幼苗节间长度的测量结果，选择2m和4m幼苗的第18节间作为实验材料，并将底部和中部节间区域分别命名为S-2-B、S-2-M、S-4-B和S-4-M。石蜡切片的研究结果显示节间组织主要由薄壁细胞、纤维细胞、次生木质部和筛管组成。四种组织在细胞大小、细胞核数量和其他特征方面存在差异(图1C)。

图1 毛竹伸长节间的生长模式及细胞形态

2.少量全长mRNA在毛竹幼苗速生过程中被转录

为了探究毛竹全长转录本的动态变化，进行DRS测序。DRS全长reads比例显示，2m幼苗的全长reads比例大于4m幼苗的(图2B)。这表明在毛竹幼苗中，mRNA降解可能随着高度的增加而增加。

3.DRS揭示了复杂的可变剪切事件

通过DRS检测到了多种可变剪切（AS）事件，其中大多数为内含子保留（IR）事件(图2D)。而IR基因的表达水平平均值(TPM)相对于非IR基因更高(图2G)。此外，大多数转录本仅显示来源于一种类型的AS事件，而发生多个AS事件的基因中，最多的是IR和5′可变剪接位点(A5SS)/3′可变剪接位点(A3SS)组合(图2F)。

图2 全长转录本的特征和AS事件

4.3'UTR在毛竹幼苗速生期间全面延长

实验结果确定了每个基因3'UTR上所有Poly(A)位点的相对位置和丰度，并选择了两个丰度最高的多聚腺苷酸位点(PAS)，根据其位置分别命名为近端PAS (pPAS)和远端PAS (dPAS)(图3A)。与S-2-B相比，S-4-B的转录本倾向于使用dPAS，这表明随着速生的进行，3'UTRs在节间底部区域延长(图3B)。GO富集分析表明，S-2-B和S-4-B组织之间发生PAS转换的基因主要与蛋白质翻译和转运相关(图3D)。

图3 毛竹速生期间poly(A)位点使用的动态变化

5.Poly(A)尾长在速生过程中的变化

DRS能够揭示Poly(A)尾长（PAL）在毛竹幼苗速生过程中的动态变化。通过比较样本PAL的中位值发现2m幼苗的PAL中位值比4m幼苗的长(图4A)。探讨PAL与转录本稳定性的关系，发现全长reads的中位PAL比非全长reads略长(图4B)。通过S-2-B vs S-2-M、S-2-B vs S-4-B、S-2-M vs S-2-M和S-4-B vs S-4-M的比较，鉴定出了具有较长和较短PALs的基因数量(图4C)。

图4 毛竹在速生过程中Poly(A)尾长的分析

6.RNA的m6A修饰在速生过程中发生变化

本研究基于DRS数据分析了四种样本的m6A修饰的转录本数量并进行差异表达分析 (图5A)。不同组织的中位修饰率差异不大，但2m幼苗的m6A修饰率略高于4m幼苗(图5B)，说明在毛竹的速生过程中，m6A修饰位点趋于逐渐去甲基化。观察m6A修饰位点在修饰的转录本中的分布，发现大多数m6A修饰存在于编码序列(CDS)内(图5C)。而转录本上m6A修饰位点的标准化分布表明，m6A在终止密码子和3'UTR附近大量富集(图5D)。另外，含有m6A修饰位点的外显子明显比未修饰的外显子更长(图5E)，这与之前报道的m6A修饰通常发生在长外显子中是一致的。全长reads的m6A比率中位数高于非全长reads(图5F)。在S-2-B和S-4-M之间，具有不同APA使用情况的基因的m6A比例中位数高于无APA转移的基因(图5G)。

图5 基于纳米孔DRS的毛竹m6A修饰分析

7.转座元件和编码基因的DNA甲基化水平在毛竹幼苗速生过程中升高

为了了解幼苗速生过程中DNA甲基化的动态，进行了BS-seq。在转座子(TEs)中检测到高水平的DNA甲基化(图6A)，而侧翼区域的甲基化水平较低。CG甲基化在蛋白质编码基因及其±2 kb侧翼区域呈钟形分布(图6B)。研究甲基化与基因表达水平之间的关系，发现非表达基因/低表达基因体的CHG和CHH甲基化水平高于高表达基因体(图6C)。另外，蛋白质编码基因的CG甲基化降低与较短的PALs相关，而CHG和CHH的甲基化水平没有显示出类似的模式(图6D)。

图6 基于BS-seq的毛竹DNA甲基化谱

8.DNA在速生过程中甲基化程度不同

为了研究不同高度幼苗甲基化特征的差异，鉴定了不同甲基化区域(DMRs)。在S-2-B vs S-2-M和S-4-B vs S-4-M比较中检测到大多数DMRs与甲基化损失相关(图7A)，这表明无论幼苗高度如何，节间中间区域的DNA甲基化水平都低于底部。CHG DMRs是最丰富的DMRs类型，其次是CG DMRs和CHH DMRs(图7B)。少量基因同时携带三种类型的DMRs (图7C)。另外基因的CG DMRs密度高于上游或下游区域，CHG DMRs基因两侧的密度高于基因内部的密度，CHH DMRs表现出相反的模式(图7D)。进一步将转录区域分为内含子和外显子，发现内含子含有的DMRs远多于外显子(图7E-F)。

图7 差异DNA甲基化谱的全局分析

本研究基于Direct RNA测序和BS-seq，探究了毛竹速生过程中全长转录本、可变剪切、APA以及DNA/RNA甲基化的动态变化，揭示了表观遗传修饰和转录后调控在毛竹快速生长中的作用，有助于我们对植物速生过程进行全面理解。