生物甲烷化固碳是一种有前途的生产可再生能源的技术。二氧化碳甲烷化通常是由附着在固体载体上的微生物群产生生物膜来完成的。虽然参与沼气升级的厌氧消化微生物群很简单，但大多数物种间相互作用背后的动力仍然不清楚。为了解析微生物在二氧化碳固定中的作用，作者采用Nanopore- Illumina混合测序方法，通过基因组中心的宏基因组学研究了四个沼气升级反应器扩散装置上的生物膜，利用基因组引导的代谢重建和通量平衡分析，提出了优势微生物的生物学作用。

文章标题：将宏基因组分箱与通量平衡分析相结合，解析厌氧二氧化碳甲烷化中的同营养化

发表期刊：Microbiome（IF：14.650）

发表时间：2022.08.03 

1. 反应器1-4，分别为不同孔径大小的不锈钢扩散器和氧化铝陶瓷膜

2. DNA 提取、Nanopore和Illumina测序

3. 宏基因组组装、分箱以及MAGs注释

4. 探针设计和荧光原位杂交

5. 代谢通路建模和通量平衡分析

1、微生物组的分类学和功能组成

在4个沼气反应器中总共回收了59个MAG，60%的MAG属于高质量MAG，被分配到8个不同的门（图1）。所有生物膜均表现出相同的类群，由5个物种代表，分别为Limnochordia sp. GSMM975、M. wolfeii GSMM957、Acetomicrobium sp. GSMM972、Firmicutes spp. GSMM966和GSMM974，几乎占每个反应器总群落的70%。两种优势菌Limnochordia sp. GSMM975和M. wolfeii GSMM957获得了几乎完全封闭的基因组。

图1. 生物膜微生物物种的系统发育树

通过共现分析研究了微生物组成员之间假定的专性或兼性互营。评估包括从批量和全面厌氧消化系统收集的134个样本数据集。该分析表明，在生物膜群落中，多个MAGs在统计显著水平上相互共发生（图2B）。5种优势MAGs之间呈显著正相关。其他5个物种（包括厚壁菌门(Firmicutes sp. GSMM974)之间的相关值都相对较低，这可能表明它们有能力建立亲和共生关系。优势微生物的相关性不仅体现在生物膜中，而且体现在AD菌群中。事实上，对Limnochordia sp. GSMM975和AD数据库中的其他四个物种的分析证实了它在AD系统中广泛存在（图2A）。

图2. 由MAGs覆盖值计算的Pearson相关系数热图和主要物种丰度直方图

2、参与生物膜形成的分子机制

优势物种在AD中的关键作用在生物膜基质形成中得到了进一步的证明。微生物分泌的EPS会产生一种包埋材料，这种包埋材料对受保护生长环境的发展至关重要。结果表明，厚壁菌门(Firmicutes spp. GSMM966)、GSMM974和Limnochordia sp. GSMM975在生物膜形成中起主导作用。这些MAG具有两组以操纵子组织的基因，它们参与EPS层的生成，具有不同但互补的作用(图3B)。

第一个操纵子包括:一个锰依赖蛋白酪氨酸磷酸酶(EpsB)，一个酪氨酸蛋白激酶跨膜调节剂(EpsC)，一个酪氨酸蛋白激酶(EpsD)，以及仅在GSMM966中存在的两个糖基转移酶(EpsF和Glt1)，属于Eps相关基因家族。第二个操纵子与细胞外多糖有关，包含一组多糖去乙酰化酶(Pgd)。此外，KEGG模块分析发现，“多胺生物合成，精氨酸 =>胍基丁胺=>腐胺=>亚细胺”(M00133)，可能与生物膜稳定有关，在微生物群落中存在的所有五种主要MAGs中都是完整的。

图3. 在反应器的膜和扩散器上积累生物膜及检测到的生物膜相关基因

3、基因组引导的代谢重建

研究了394个KEGG模块的完整性水平，对59个MAG进行了代谢通路重建和生物学作用解释。人工检测显示，12%的模块是广泛存在的“核心”模块。模块完整性分析表明，两个古菌种(嗜热菌Methanoculleus therophilus GSMM927和M. wolfeii GSMM957)都有完整的氢基因营养特异性模块。两个优势微生物M. wolfeii GSMM957和Limnochordia sp. GSMM975的代谢图谱显示了非常复杂的代谢，都有萜类生物合成的途径（图4）。GSMM975具有复杂的中枢碳代谢，包括完全的糖酵解途径和几乎完整的戊糖-磷酸分流。GSMM957的氨基酸生物合成途径几乎能够合成整套氨基酸。然而，GSMM975的氨基酸代谢具有低合成潜力。

图4.  A,B两个优势种的代谢图谱；C 微生物群落的FISH图像

4、计算机模拟的核心生物膜群落

模型模拟结果描述了最相关的交叉进给作用，两个子集被表示为网络（图5）。所有的MAG都导入H2，但CH4生产只分配给M. wolfeii GSMM957，它是建模群落中唯一的古菌，CO2主要由Limnochordia sp. GSMM975吸收。醋酸盐是由Limnochordia sp. GS975产生的，以支持其他MAG的生长（图5A）。参与微生物群落成员交叉进食的氨基酸是L-谷氨酸，1-天冬氨酸，L-谷氨酰胺，L-丝氨酸，L-苏氨酸，L-丙氨酸和甘氨酸（图5B）。有针对性的干预措施主要减少了整体氨基酸和CH4的生产（图5C）。

图5.  A, B生物膜或培养基中最丰富的物种之间发生的代谢交换的可视化；C原料和微生物丰度变化对氨基酸、H2、CO2和CH4产量的影响

基于不同物种间氨基酸交换的有效合作是维持一个稳定过程的必要条件。考虑到生物膜形成在几种反应器配置的相关性，这五种微生物在接种体中的存在将被认为是一个理想的特征。随着微生物领域的最新发展，应用FBA来检查物种相互作用有助于合理修饰在生物技术、精准农业或生物修复战略中发挥作用的微生物群落。

De Bernardini, N., Basile, A., Zampieri, G. et al. Integrating metagenomic binning with flux balance analysis to unravel syntrophies in anaerobic CO2 methanation. Microbiome 10, 117 (2022). //doi.org/10.1186/s40168-022-01311-1