桃金娘（Rhodomyrtus tomentosa）是一种重要的药用植物，成熟果实呈紫色。本研究利用PacBio HiFi和ONT ultra-long测序技术，组装得到染色体级别Gapfree的桃金娘T2T基因组。结合系统发育分析、比较基因组和多组学联合分析，对桃金娘果实中花青素积累和果实着色机制进行解析。

文章题目：Gap-free genome assembly and comparative analysis reveal the evolution and anthocyanin accumulation mechanism of Rhodomyrtus tomentosa

发表期刊：Horticulture Research（IF=7.291）

发表时间：2023.01

1、桃金娘T2T Gapfree参考基因组

该研究对“罗浮山桃金娘1号（LFSTJN-1）”（图1A）进行survey分析，预估基因组大小为450.77 Mb，杂合度为0.29%。对LFSTJN-1进行基因组测序，共获得~74.08× PacBio HiFi数据，~24.44× ONT ultra-long数据。

使用hifiasm和NextDenovo对PacBio hifi和ONT数据分别进行组装，使用NextPolish进行纠错。利用Hi-C数据对两个组装版本进行3D-DNA处理，纠正组装误差，去除冗余序列。用hifi的组装填补ONT组装的gap。

填补完所有gaps，获得桃金娘gap-free组装，组装大小为470.35 Mb，contig N50为43.80 Mb。用7碱基端粒重复序列（CCCTAAA），鉴定桃金娘基因组全部22个端粒，构建了11个T2T伪染色体（图1C），并使用TRF鉴定候选着丝粒串联重复序列，在11条染色体中均鉴定出着丝粒，长度为0.35Mb～3.49Mb（图1C）。

图1 桃金娘的基因组组装和基因组特征展示

2、桃金娘基因组质量评估及注释

为了确认桃金娘T2T基因组的组装质量，该研究用二代、三代测序数据进行基因组mapping，比对率均>99.9%。此外，使用eudicots_odb10以及embryophyta_odb10两个BUSCO库对组装完整性进行评估，BUSCO分别为97.7%和99.0%。此外，将不同组织和发育阶段的RNA-Seq数据进行mapping，比对率为92.4%-96.5%。对LTR的完整性检测，该组装LAI值为16.16，与已发表的A. chinensis cv. 'Hongyang'等gap-free组装的结果相似。这些数据均表明桃金娘基因组的组装的完整性、准确性较高。

对桃金娘T2T基因组进行注释，重复序列比例为50.92%（239.51Mb），其中190.23Mb（79.42%）为LTR，共注释得到33,382个蛋白编码基因，注释BUSCO为93.7%。

3、桃金娘基因组进化分析

系统发育分析表明，桃金娘属和石榴属的分化时间约为14.37 MYA，有953个和714个基因家族在桃金娘基因组中分别表现为扩张和收缩（图2A-B）。同时，在与桃金娘的共线分析中，巨桉（E. grandis，桃金娘科桉属）比番石榴（P. guajava，桃金娘科番石榴属）检测到更多的染色体倒置，这可能导致桃金娘科内部的分化（图2C）。

桃金娘科物种Ks分布图显示，桃金娘与其他桃金娘科植物共享近期的WGD事件（图2D）。共线性分析也表明，桃金娘保留了与番石榴等桃金娘科植物相似的祖先多倍体特征。根据Ks分布，进一步确定桃金娘科植物WGD事件发生在66.58 ~ 95.50 MYA（图2A）。

图2 桃金娘系统发育分析及共线性分析

4、桃金娘各器官间基因表达模式及果实软化相关代谢分析

为探讨桃金娘各器官的基因表达模式，作者对10种不同器官、不同发育阶段样本的25,038个表达基因进行加权基因共表达网络分析（WGCNA）。

桃金娘果实的淀粉含量随着果实的发育而下降（图3C）。根据KEGG注释，该研究确定了20个淀粉降解相关的基因，表达分析表明，淀粉转糖过程的基因（GWD/ISA）主要在F1阶段表达（图3D）。此外，这些参与淀粉降解的基因在叶片或茎衰老过程中也高表达，与物种器官衰老过程一致。

图3 淀粉在桃金娘不同组织中的基因表达模式以及淀粉降解通路

5、桃金娘果实发育中与色素和花青素合成相关的代谢物和基因表达模式

桃金娘果实着色是成熟期的指示性特征（图4A）。形态学观察和总花青素含量的测定表明，在F3至F4期间，桃金娘果实中花青素含量急剧增加，果实颜色也变为紫色（图4A-B）。据此，module24中的基因在与类黄酮合成和代谢有关的途径中高度富集，特别是花青素的合成和代谢。

为研究桃金娘的果实着色和黄酮类化合物积累之间的调控机制，对黄酮类化合物进行代谢组学研究。作者将在桃金娘三个器官中检测到189种黄酮类化合物，划分为9个丰度clusters（图4C）。

深入探究发现，在花青素合成的核心过程中，所有已知的核心酶RmCHI-1、RmCHI-2、RmF3H、RmDFR和RmANS均在F3期高表达。这一趋势与桃金娘果色花青素含量从F3到F4的急剧变化和增加相对应（开花后75 ~ 90 d；图4C-D）。

图4 代谢物丰度聚类与类黄酮（主要为花青素分支）化合物合成途径

6、桃金娘科植物果实色素和花青素的积累

本研究选择番石榴（桃金娘科番石榴属物种，绿色果皮肉质果实）与桃金娘进行比较。与桃金娘不同，在番石榴果实中参与花青素合成相关的核心基因下调表达（桃金娘中上调）。这种表达差异表明花青素合成活性在番石榴果实中表达低，与番石榴果实颜色相一致（图4D-E）。

此外，对两种植物花青素合成下游途径进行比较研究，发现花青素糖基化所需的OMT基因在桃金娘中存在拷贝数变异（CNV），由此产生的两个基因拷贝（RmOMT- 4/RmOMT-5）位于1号染色体的末端（图5A）。其中，RmOMT-4的表达在果实中特异性增加，而RmOMT-5也在果实成熟的各个阶段有表达，但在根部的表达最高（图4D）。

同时，以往研究表明GST基因家族参与了花青素的运输过程，根据亚家族分析表明，桃金娘中的参与花青素运输的GSTU亚家族基因比番石榴多（76>51；图5B）。表明CNVs与花青素糖基化之间存在潜在关系，进一步影响桃金娘和番石榴的果实着色。

图5分析基因拷贝数、MYB和GST基因家族系统发育、MYB差异表达基因研究

7、MYB转录因子正选择对桃金娘花青素合成的潜在影响

本研究对MYB转录因子深入探究发现，桃金娘和番石榴中MYB转录因子数量相似。其中，有4个MYB基因在WGCNA中聚到Module24，在番石榴中这4个基因未检测到高表达（图5C），而其中2个（RmPAP1和RmPAP2）的同源基因在拟南芥中已被证实可以促进花青素合成，这2个MYB转录因子的共表达网络包含9个花青素合成相关基因（图5D）。

此外，对桃金娘和其他桃金娘科植物进行正选择分析，发现桃金娘中受正选择的基因有2432个，其中包含32个MYB转录因子，深入分析发现一些花青素MYB正调控基因在种间表达趋势的差异和进化过程中的正向选择，可能倾向于导致桃金娘果实着色（图5E）。

本文公布了桃金娘科首个T2T基因组——桃金娘（R. tomentosa）基因组。作者通过多组学研究，揭示了桃金娘中花青素的主要成分及其合成途径，进一步丰富了对桃金娘科肉质果实发育的认识。结合比较基因组和基因表达分析，探究了果实花青素积累和着色机制。

桃金娘Gap-free基因组为研究桃金娘科肉质果实的起源，以及加速桃金娘科植物的遗传改良奠定了基础。

参考文献：

Fangping Li, et al., Gap-free genome assembly and comparative analysis reveal the evolution and anthocyanin accumulation mechanism of Rhodomyrtus tomentosa. Horticulture Research, 2023.